Skip to content

Terapia xenética por células nai hematopoiéticas leva a unha mellora clara dos órganos viscerales e da aparición tardía de anomalías neurológicas no Murine Modelo de enfermidade de Niemann – Escolla deficiente en Skingomyelinase en ácido

Posted in Articles

Abstracto

Niemann – Pick (NDP) Tipo Enfermidades de tipo A e B Resultados da actividade deficiente da Spingomyelinase deficiente (ASM). Actualmente, ningún tratamento está dispoñible para unha ou outra forma de NDP. Usando o modelo de rato de Knockout ASM, evaluamos os efectos da terapia de xénero de células nai hematopoiéticas ex vivo no fenotipo NDP. Trinta e dous ratos de Asmko recentemente nado foron precondicionados con radiación de baixa dose (200 cgias) e transplantadas con células de medula ósea de Asmko foron transducidas cunha codificación de vector retrotropic retroviral para o ASM humano. O transplante de células derivadas do doador varía de 15 a 60% en función da análise de hibridación in situ sobre os glóbulos brancos periféricos e levouse a cabo no 92% dos animais enxertados. Os altos niveis de actividade ASM (ata cinco veces superiores ao normal) atopáronse en animais enxertados ata 10 meses despois do transplante e a duración da vida foi ampliada por unha media de 5 a 9 meses polo procedemento de terapia xenética. As análises bioquímicas e histolóxicas dos tecidos obtidos de 4 a 5 meses despois de que o trasplante mostre un aumento nas actividades de ASM e unha redución significativa no almacenamento de Sphingomielin no bazo, o fígado e os pulmóns tratados, os principais sitios patolóxicos do tipo NDP B. O A presenza de Purkinje Cell Neurons tamén aumentou significativamente no grupo tratado en comparación cos animais non procesados 5 meses despois do transplante, e observouse unha redución da memoria das neuronas da medula espiñal. Non obstante, todos os ratos enxertados terminaron desenvolvendo unha ataxia e morreron antes que os ratos normais. En xeral, estes resultados indican que a terapia germinal hematopoiética debe ser efectiva para o tratamento do tipo NDP non neurológico B, pero que melloraron as técnicas para a orientación das células de inxea e / ou a enzima expresada en sitios patolóxicos específicos. O sistema nervioso central debe ser mellorado. Desenvolvido para obter un tipo efectivo dun tratamento NDP.

Acceso proporcionado por

Introdución

Niemann – Pick (NPD) Enfermidade do tipo A e B son dúas clínicamente distintas Formas dun trastorno de almacenamento lisosomal causado pola deficiencia hereditaria en Spingomyelinase ácida (ASM; EC 3.1.2.12). Actividade.123 O tipo A NDP maniféstase por un atraso no desenvolvemento, hepatosplenomegalia e unha evolución neurodegenerativa rápidamente progresiva que xeralmente leva a morte a 3 anos. Doutra banda, o tipo B NDP caracterízase por hepatosplenomegalia, infiltratas pulmonares que levan a infeccións respiratorias frecuentes, implicación neurológica mínima ou cero e supervivencia adulta ou adulta. Spingomyelin e colesterol acumúlanse en pacientes con dous fenotipos NDP, pero os mecanismos fisiopatolóxicos específicos subxacentes á súa evolución clínica distinta permanecen descoñecidos.

Nos últimos anos, os xenes de ADNA e Murine ASM foron illados e expresados, 4567 mutacións que causan enfermidades foron identified8 e modelos de murino inactivable ser produced910. As características clínicas, bioquímicas e patolóxicas do deficiente en ASM (ASMKO MICE) imitan o tipo humano tipo A e B ndps, ofrecendo así a posibilidade de obter novas informacións sobre a patoxenesia da enfermidade e desenvolver e avaliar novos enfoques terapéuticos.

Actualmente, ningún procesamento está dispoñible para unha ou outra forma de NDP. O transplante hepático nun home con NPD tipo A foi con éxito de 1112 e, aínda que a membrana amniótica ósea e as probas de transplante de transplante de medula ósea foron informados, 13141516, só se estudaron un pequeno número de pacientes humanos.

contrario a Estes estudos en humanos, unha análise completa do BMT levouse a cabo no rato Asmko1718. Esta técnica levou a unha mellora na vida, as melloras histolóxicas e bioquímicas de varios órganos clínicamente importantes, incluíndo o fígado e o bazo, e unha aparición de fenotipo neurológico.Así, o uso de BMT aloxénica para o tratamento do tipo B NDP é fundado científicamente, pero é complicado pola falta de doadores irmáns e irmáns totalmente compatibles na maioría das familias NDP, a morbilidad ea mortalidade asociada ao uso da irradiación do corpo total e reactivos inmunosupresivos., así como a enfermidade de enxerto contra o anfitrión (GVHD).

O enxerto autólogo de células de medula ósea xeneticamente modificado (terapia xenética por células nai hematopoiéticas, HSCGT) é, polo tanto, unha alternativa razoable ao TMO alogeneico para o tratamento desta enfermidade.19 Elimina os dous principais problemas de Donante e Dispoñibilidade GVHD, teoricamente conducindo a unha diminución da morbilidade e da mortalidade. Ademais, as células corrixidas enzimáticamente obtidas por transferencia de xenes poden expresar / segregar a enzima a niveis maiores que os que se atopan nas células normais, quizais levando a unha mellor eficiencia clínica.

experimentos. Descubrido neste manuscrito foi realizado Para avaliar se o trasplante de baixa dose con células hematopoiéticas de transducción retroviral pode realizarse a longo prazo, e se o transplante destas células en Asmko recentemente nado pode ter efectos terapéuticos. Ademais, comparamos a eficacia deste enfoque terapéutico cos resultados previamente obtidos polo trasplante de células de medula ósea normal (é dicir, BMT).

transplante e enxerto

trinta e dous asmko Os ratos recentemente nados (de 2 días de idade) foron transplantados con 1 × 10 6 celas de medula ósea que foron transducidas cun vector retroviral ASM / MFG ecotrop (ver materiais e métodos para máis detalles). A irradiación total do corpo de sucbletales (200 cgy) foi utilizada para facilitar o transplante con células doador masculinas, polo que os niveis de socket de transplante poden ser avaliados en destinatarios por hibridación in situ usando unha sonda específica do cromosoma Y17. Cinco meses despois do transplante, a WBC dos doadores detectáronse no 92% das femias transplantadas ea porcentaxe destas células (é dicir, o injerto) variaba entre o 15 eo 60%, porcentaxe de toma de enxerto lixeiramente inferior a que previamente obtido por BMT17. Todos os animais enxertados estaban decididos a ser positivos para a presenza de secuencias vectoriais nas súas células sanguíneas brancas periféricas 3 e 8 meses despois do injerto usando un método de selección de PCR (non presentado).

Actividades ASM no WBC de Asmko rato enxerto

As actividades de ASM WBC foron medidas mensualmente en animais individuais despois do procedemento de transplante. Como se mostra na Figura 1, os ratos tratados ASMKO tiñan actividades de ASM significativamente maior que as súas rangos normais (P < 0, 002). Os ratos ASMKO non tratados teñen < 1% da actividade normal de ASM WBC.9 de 1 mes e ata o quinto mes despois do transplante, os niveis de actividade da actividade de WBC ASM en Tratado Os animais aumentaron gradualmente e estabilizáronse despois. Non obstante, non se observou unha correlación directa entre a actividade de ASM WBC e a supervivencia (ver a figura 2 a continuación) foi observada ao analizar animais.

Imaxe

ASM Actividades no WBC Tratado Asmko e control de animais. As mostras de sangue de órbita retiniana foron tomadas cada mes despois do transplante e as ensaios de actividade ASM realizáronse en WBC, como se describe en materiais e métodos. O gráfico mostra os valores medios e os erros estándar dos ratos normais medios (▪), ASMKO (•) e ASMKO () transplantados. N = 32 para asmko enxerto e cinco para animais de control normais e asmko sometidos a irradiación. Teña en conta que os animais de control de Asmko non tratados sobreviviron só ata os 6 meses de idade.

imaxe de tamaño completo

imaxe

Kaplan – Meier Diagram que mostra unha maior supervivencia de Asmko Mice presentada a HSCGT. Normal (▪), ASMKO (•) e ASMKO transplantado ().

Imaxe de tamaño completo

As mostras de soro de rato inxectadas foron analizadas por ELISA para a presenza de anticorpos anti-hasm e inmunoprecipitación a Determine se estes anticorpos inactivados actividade enzimática. Todos os animais injertados con éxito tiñan niveis medibles de anticorpos anti-hasm no seu plasma, pero en todos os casos estes anticorpos non inhibiron a actividade inmunoprecipitada de ASM (é dicir, non eran neutralizando, non representados).

Supervivencia e crecemento de MICE ASMKO enxerto

Os efectos do procedemento de terapia xenética sobre a supervivencia dos ratos ASMKO están demostrados na análise de Kaplan-Meier que se mostra na Figura 2. A vida de Os animais que testemuñan a irradiación tipo salvaxe (é dicir, irradiada pero non transplantada) eran normais (> 1 ano). ), mentres todos os ratos Asmko sometidos ao control da irradiación morreron entre 6 e 7 meses (idade media á morte 6, 4 meses). O aumento da lonxevidade observouse en animais tratados con terapia xenética. Por exemplo, a 8 meses despois do transplante, preto do 75% dos animais tratados con Asmko sobreviviron, mentres que 10 meses despois do trasplante, este número reduciuse ao 40%. Non obstante, a pesar da súa maior vida, A ataxia tornouse evidente nos ratos transplantados ao redor de 6 meses e todos os animais tratados (con excepción dos que foron mortos prematuramente por fins experimentais) finalmente morreron á idade de 1 ano .. Antes dos 6 meses de idade, os esquemas de tratamento do grupo de tratamento foron similares aos do grupo de control normal, pero perderon peso e seguiron unha evolución neurodegenerativa similar á dos ratos Asmko. Así, o procedemento de terapia xenética atrasou a aparición de síntomas neurolóxicos, pero non os impediu.

ASM Actividade e contido de Sphingomyelin nos órganos

Cinco meses despois do tratamento, un grupo de Seis animais enxertados (así como tres animais de control normais e afectados) foron mortos e infundidos de salina para cobrar o sangue dos órganos. Os fígados, as ratas, os pulmóns, os riles, os corazóns e os cerebros foron disseguidos e conxelados. Os niveis de actividade de ASM e os contidos de Sphingomyeline foron avaliados nestes órganos e os resultados móstranse na Figura 3. Débese notar que os niveis de actividade ASM no bazo, o fígado e os pulmóns dos animais ASMKO tratados eran uns 90, 65 e 40%. De normal, respectivamente, significativamente por riba dos valores que se atopan en ASMKO animais non tratados. 9 (O valor de P durante a comparación de actividades ASM nestes tecidos entre os ratos ASMKO Tratados e non tratados foi < 0, 0001.) Por outra banda, os niveis de actividade ASM atopados no cerebro, os corazóns e os riles dos animais tratados non eran máis estatísticas que os atopados en animais non tratados (valores de P > 0, 1).

imaxe

Actividades ASM e contido de Skingomyeline en tecidos ASMKO e animais de control tratados. (a) Cinco meses despois do transplante, as actividades de ASM foron medidas en varios órganos, como se describe en materiais e métodos. O histograma mostra unha comparación de actividades medias de ASM nos animais tratados (n = 6) coas actividades detectadas no mesmo control normal e envellecido de tecidos do rato (n = 3). As liñas verticais indican o erro estándar da media. (b) Os niveis de esfingomielina foron medidos nos mesmos tecidos que os animais tratados e están representados pola porcentaxe de redución en comparación cos animais de control de ASMKO non tratados da mesma idade (n = 3).

Imaxe de tamaño completo

En forma significativa, observouse unha correlación significativa entre os niveis de enzimas ea autorización do substrato. De feito, en ratas e fígados, onde as actividades de ASM foron significativamente altas, a acumulación de Sphingomielin reduciuse a niveis case normais (o valor de P cando a comparación do contido de esfingomielina destes tecidos entre asmko tratado e os ratos normais foi > 0, 1). Unha situación intermedia observouse nos pulmóns, mentres que no cerebro, corazóns e riles, non había practicamente ningunha actividade detectable de ASM ou reducindo a esfingomielina.

Efectos patolóxicos

Figura 4 espectáculos Un representante de análises histolóxicas de cortes de tecido de fígado, pulmóns e ratas de indicadores tratados de rato e control de irradiación (Asmko e normal) 5 meses despois do transplante. Teña en conta que ao redor da idade de 5 meses, os ratones de Asmko (f) non tratados tiñan un importante almacenamento de lípidos en comparación cos animais normais (paneis A – C). Moitas células espumantes pálidas foron espalladas no fígado e as seccións de bazo e unha infiltración significativa de alveoli e septa foi observada nos pulmóns, obstruíndo o tracto respiratorio. En particular, os tecidos dos animais tratados (paneis G – i) mostran unha acumulación de lípidos significativamente máis baixos que a dos animais de control de Asmko non tratados.Na figura 5, unha redución do material de almacenamento na medula espiñal dos animais tratados móstrase por unha cor azul Azure II-metileno.

Imaxe

Histoloxía non SNC. Manchando con hematoxilín-eosina de fígado, pulmón e bazo de controis normais representativos (A – C), control de Asmko (D – F) e asmko rato (G – I) tratados 5 meses despois do transplante (ampliación inicial × 200).

imaxe de tamaño completo

imaxe

Histoloxía da medula espiñal. ASMKO Cordón espinal do rato Asmko (a) de 5 meses e rato Asmko (b) transplantado. As frechas indican gránulos altamente basófilos no citoplasma do motor de Mouse ASMKO. Teña en conta a redución deste material en animais transplantados.

Imaxe de tamaño completo

Para estudar os efectos do HSCGT sobre a perda das células Pukinje (PC) que ocorre en Asmko Rice , nos compararon controlada e seccións cerebrais tratados (transplante 5 meses) immunoreagi cun anti-soro calbindine, unha proteína de unión de calcio expreso exclusivamente en PC (Figura 6). ) Teña en conta a perda de PC marcada nun control de Asmko non tratado (Panel A) con respecto a unha sección representante dun rato tratado (panel b). De feito, un só lóbulo de cerebelo mostra unha cor de PC no animal de Asmko non tratado, mentres que as computadoras están presentes en todo o cerebro tratados con ratos de control de irradiación normal. Esta figura tamén mostra que o procedemento de irradiación subtowal (200 CGY) utilizado para facilitar o transplante de células de transplante non prexudicou o desenvolvemento e distribución de PCs na cerebel normal do animal.

Imaxe

Immunohistoquímica das células Purkinje. Corte sagital de ASMKO (a) de 5 meses, transplantado Asmko (B) e control normal de irradiación (C) Cerebella. Teña en conta que as células Purkinje están presentes nunha extensión moito máis longa do cerebelo tratado do rato con ratones non tratados.

Imaxe de tamaño completo

Discusión

O propósito deste O estudo foi para determinar se o HSCGT podería ser un enfoque terapéutico eficaz para NDPs de tipo A e / ou B. O modelo do rato NPD (ASMKO) ten unha patoloxía do sistema nervioso central e visceral. Moi similar ao dos pacientes con NDP humano e é un excelente sistema para avaliar esta estratexia terapéutica e outros. Anteriormente informamos os resultados de BMT en Asmko Rice, 1718 e descubriron que un réxime de condición precondicionado subletal nos animais recentemente nados podería provocar un transplatamento de alto nivel sen aumentar a mortalidade ou artefactos patolóxicos. Ademais, demostramos unha alteración significativa pero incompleta do fenotipo nos ratos tratados. En particular, o fenotipo histolóxico foi mellorado significativamente nos órganos reticulos-endoteliais ea aparición de ataxia foi atrasada (ao mesmo tempo que unha maior retención de neuronas de PC), pero todos os animais tratados finalmente desenvolveron síntomas neurolóxicos. E morreu prematuramente .

O HSCGT ten varias vantaxes potenciais sobre o BMT en pacientes con NDP humano, incluído o feito de que as células de transplante non necesariamente deben ser derivadas de donantes normais ou heterocigotos compatibles. Ademais, as células autólogas transducidas poden potencialmente sobreexpresar o transxeno, quizais levando a unha resposta terapéutica aumentada. Neste estudo, obtivéronse actividades de ASM WBC maior do normal de varios animais tratados durante o período de aprobación de 10 meses. e descubrimentos bioquímicos en órganos viscerales e neurodegeneración atrasada, todos os ratos transplantados finalmente desenvolveron unha ataxia e morreron prematuramente.

Debe notar que as taxas de injerto obtidas polo Protocolo de Terapia Xénica. Como se determina pola hibridación in situ Cunha sonda específica do cromosoma Y, era menor que os obtidos por BMT17, a pesar de que o procedemento de trasplante (por exemplo, o número de células, irradiación) Dose) era o mesmo. Estes resultados destacan varias diferenzas importantes entre os dous enfoques terapéuticos.Por exemplo, durante o transplante de medula ósea normal, non se realizou ningún manexo de células, é dicir, o contido total das células da medula ósea tomadas de ósos de doadores normais foi transplantado sen cultivo móbil ou dividido. No protocolo de terapia xenética, unha poboación de células mononucleares, illada por centrifugación discontinua con gradiente de densidade, mantívose en cultivo durante 2 días en presenza de factores de crecemento e transducido co vector retroviral. Isto pode explicar os niveis máis baixos de injertos observados.2021

Con todo, a pesar dun transplante máis baixo, xeralmente os niveis máis elevados de actividade enzimática foron detectados nos GBS e os órganos de órganos tratados con terapia. Xenio en comparación cos que reciben un TMO. Estes datos son consistentes cos doutros investigadores que mostraron unha expresión a longo prazo e elevada de transxénes en ratones ou ratas enxertadas con células hematopoiéticas transducidas por MFG.222324 de acordo coa expresión de enzimas elevada, unha corrección case completa. De retículo Sistema endotelial A patoloxía do sistema, que só se observou cando o trasplante de trasplante de trasplante permitiu obter un transplante de alto nivel (é dicir > 90%) 18, en animais Tratado con terapia xenética enxerto nun 30% ou menos.

A perda de neuronas de PC no Cerebel do Rato NPD é unha das principais características da súa patoloxía de SNC91825. Tamén é a probable causa da ataxia progresiva, que finalmente conduce á morte. Informouse que os ceramides eran un factor crítico na supervivencia das neuronas do Crebelan PC.26 A inhibición da síntese de ceramida causou unha diminución da supervivencia celular, acompañada dunha indución da morte de células apoptóticas e unha diferenciación dendrítica aberrante de PC, Sen modificación detectable doutras lesións cerebelares. Os neurones.26 Por outra banda, durante a exposición á esfingomiase bacteriana, a rama de supervivencia e dendrítica do PC aumentou, probablemente debido ao aumento da produción de ceramidas. Para controlar a perda de neuronas de PC no cerebro dos animais tratados con Asmko, realizamos unha inmunohistoquímica usando un antiserum con Calbindine. Calbindine D28K pertence á gran familia de EF, que se supón que funciona, en parte, como un buffer citosólico cálcico. Codifica unha proteína de unión de calcio expresada no cerebelo exclusivamente en PC.272829. Mes despois do transplante, houbo un aumento no número de PC en ratones tratados con ratones de control irradiados afectados. Estes resultados foron moi probablemente debido á presenza no SNC de células microgly derivadas da medula ósea e transducidas por medios retrovirales capaces de secretar MSAs en cantidades suficientes para atrasar a morte celular específica da enfermidade nas neuronas do PC. Resultados similares foron observados nos nosos estudos en BMT.18 Tamén é interesante notar que estes resultados obtiveron a pesar de que non se puido ver ningún aumento detectable na actividade ASM nos homogenatos cerebrais. Os animais tratados. Este resultado é consistente co feito de que moi poucas células derivadas do doador foron capaces de atravesar a barreira sanguínea despois da irradiación subletaxe e un trasplante de 17 anos e indicar que os niveis moi baixos de MSA son suficientes para atrasar a morte de CP. , sen avisarlles.

Entón, como o BMT alogeneico, o HSCGT aparece como unha opción terapéutica viable para o tipo de NPD B. É particularmente notable que se obtiveron efectos equivalentes histolóxicos / clínicos Os procedementos BMT e HSCGT, a pesar de que os niveis de injerto foron obtidos por eles. Este resultado, asociado ao feito de que a necesidade de que a embalaxe inmunosupresiva sexa considerablemente reducida durante o transplante de células autólogas con respecto ás células alóxenas, reforza a idea de que o HSCGT pode constituír o tratamento adecuado para os pacientes con NPD tipo B humano. Non obstante, hai que sinalar que, a pesar destes resultados fomentados no Murine Model, a obtención dos mesmos resultados nos pacientes humanos é agora problemático porque os vectores de transferencia de xenes actualmente dispoñibles non poden traducir efectivamente as células nai hematopoiéticas hematopoiéticas eficientemente humanas. Así, o BMT alogeneico segue sendo a única opción terapéutica dispoñible para individuos con tipo NPD B.No que se refire ao tipo A NDP, os datos indican que os baixos niveis de expresión do ASM no CNS poden levar a melloras neurolóxicas parciais, pero é improbable que, como o BMT, evite a evolución rápida e neurodegenerativa desta enfermidade. Así, hai que desenvolver novos enfoques para mellorar a distribución de células transplantadas no CNS e / ou aumentar a expresión do ASM derivado do vector no cerebro do tipo NPD a un tratamento eficaz. P.>

retroviral Construción vectorial e preparación de células de produción anfotropica

O vector retroviral ASM / MFG foi construído inserindo o ASM CDNA ASM de lonxitude total (HASM) no Vector MFG como se describiu anteriormente .30 En definitiva, PCR Mutagenesis foi usado para introducir un sitio de restrición NCOL no codón de iniciación da tradución do tipo de Nature Hasm para optimizar a tradución e facilitar a clonación. Para xerar liñas de móbiles retrovirales de anfotropic, o vector ASM / MFG foi co-electerroporado con PSV2Neo plásmido en células de envasado anfotropic envam1231 e sometido a unha selección de G418. Os ambientes foron recollidos a partir de clons individuais de células de produción viral e o clon de productores que conduce á maior actividade ASM despois da transducción das células NIH-3T3 foi utilizada para experimentos posteriores. O título do productor Clone estimouse medindo o aumento da actividade ASM obtida despois da transducción das células NIH-3T3 con dilucións en serie do medio das células productoras, así como por Southern Blot. Métodos similares para estimar títulos baseados na actividade enzimática foron publicados por varios outros vectores MFG en ausencia dun sistema de marcador seleccionable.3233

Preparación de celas de produción ecolóxica

para preparar eco -Producción de células, a liña de células de produción anfotropica co título máis alto foi cultivada nunha confluencia dun 80% no ambiente de aguia modificado de Dulbecco (DMEM, GIBCOBRL, GAITHERSBURG, MD, Estados Unidos) que contén 20% de becerro fetal Serum e antibióticos. Despois de 24 h, o medio foi recollido, concentrado usando 300 K PALL Filtron Corporation, East Hills, NY, Estados Unidos), combinado con medianos frescos que conteñen antibióticos e polibbubere. 8 μg / ml (Sigma, St Louis, MO, Estados Unidos) .. O proceso repetiuse tres veces durante un período de 3 días, entón as células de produción ecolóxicas transducidas foron collidas e diluídas nunha concentración final de 100 células por día. 10 ml para a posterior replicación e clonación. O ADN foi preparado a partir de clons de células ecotrópicas individuais e sometido a unha PCR cuantitativa (ver a continuación) e o clon co maior número de copias do provirus foi conservado e usado para a transducción das células. ASMKO rato medula ósea.

Preparación de células de doadores

A colonia do rato ASMKO foi establecida a partir de pares reprodutivos heterocigotos obtidos pola orientación xenética das células nai embrionarias 129 / sv, e por microinxección en c57bl / 6,9 blastocistos Asmko rato (de 8 a 12 anos) semanas) utilizáronse como fonte de células doadores. Para obter células de medula ósea nucleada, os animais doadores foron pretratados con 5fu (150 mg / kg) 48 h antes da morte por dislocación cervical. As células da medula óseas foron recollidas a partir das tibias e as femeiras aclarando as cavidades espiñalas cunha solución de Hank buffered (10 μm / ml hepes, pH 7, 5) e unha agulla de 27 calibre. As suspensións monocelulares obtiveron as células a través dun 40 μm Nylon Cell Dieve (Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, EUA). Células de medula ósea de baixa densidade (< 1, 085 g / cm 3) foron illadas por centrifugación de gradiente de densidade discontinua usando o nycoprep (Nycomed Pharma como, Oslo, Noruega) 35 e lavado cunha solución de Hanks buffered que contén un soro de becerro fetal de 5% de calor. As células foron entón contadas, diluídas coa concentración desexada e transducidas retrovirencialmente como se describe a continuación.

Transducción retroviral de células de medula ósea

Os sobrenadantes de virus ecoções concentráronse usando 300K de tubos de filtro de macrosep segundo as instrucións do fabricante.Para lograr a transdución retroviral, preto de 1 x io9 células de medula ósea dos doadores de Masculino Asmko foron cultivados durante 48 horas en 10 ml DMEM que conteñen o ecotrope concentrado / MFG Ecotope Retroviral Vector, o 20% do soro de becerro fetal inactivado pola calor e os antibióticos. As culturas tamén contiñan CSF (50 ng / ml), IL-3 (20 Ng / ml), IL-6 (10 Ng / ml) (Genzyme, Cambridge, MA, EUA) e 8 μg / ml de polibrene.36373839. Durante as primeiras 24 horas, o medio ambiente foi substituído por un medio fresco que contén o virus recentemente recollido e concentrado, factores de crecemento fresco e polibrew.

análise de PCR para detectar o vector ASM / MFG

Usouse un cambio no noso procedemento descrito previamente.30 MWG Secuencias de ASM endóxenas e MFG endóxenas endóxenas e MFG foron amplificadas usando un sinal de sentido común, Exon 3 ‘TGCTGAGGAGGAGGA CAA -3′ (P1), construído a partir de ASM Human and Murin Exon 3 e dous cebadores antisense específicos, 5’-gggtaggtgacagaagattga-3 ‘(P2) e 5′-ggcacaAGAGCAGCAG-3’ (P3), construído a partir do rato e humano ASM INTRON ASM 6, respectivamente. Os pares de cebadores P1 e P2 amplificaron un produto xenómico xenómico xenómico murino específico de 211 PB, mentres que os pares de cebadores P3 amplificaron un produto de 554 BP do vector MFG específico para o home. Cada reacción de amplificación (uns 100 μL do volume final) contiña 200 PMOL de Primer P1, 100 PMOL Primers P2 e P3, 300 NG ADN xenómico, 1x PCR Buffer, 1, 5 mm de MGCL 2, 5U TAQ polimerase (Promega, Madison, WI, EUA) e 200 m m cada un de DNTP. Xerouse unha curva estándar usando mesturas de ADN como se describe anteriormente.20 despois da amplificación (30 ciclos, cada un composto por 1 minuto a 93 ° C, 61 ° C e 72 ° C), os produtos de PCR foron separados por electroforesis nunha solución de agarosa en 1, 5%. Xeles e coloreados con bromuro de etidium. A intensidade das cintas foi determinada usando o paquete de software NIH Imager.

Transplante de trasplante de trasplante

Trinta e dous rato máis antigos de 2 días foron utilizados como receptores. Antes de recibir o transplante, os destinatarios foron sometidos a unha única dose de irradiación total do corpo de 200 cgia desde unha dobre fonte de 137 cs (taxa de dose, 80 cy / min). Cada animal recibiu un total de 1 × 10 6 células / g de peso corporal inxectado por vía intravenosa. Os compañeiros de lixo da mesma idade (normais e asmko, n = 5 por cada un) foron utilizados como indicadores de irradiación (é dicir, irradiados, pero non transplantados). Os animais mantivéronse segundo un ciclo de luz / escuro de 12 horas, auga a vontade e purina para roedores Purina 5001. Non se administraron antibióticos ou outro tratamento de apoio a ningún dos animais antes ou despois do trasplante.

Avaliación post-enxerto

Os pesos de animais e cookies transplantados foron rexistrados mensualmente. O sangue periférico tamén foi obtido por hemorraxia da órbita a retina para unha análise mensual das enzimas en glóbulos brancos (WBC) (ver a continuación).

Hibridación in situ do cromosoma Y

As mostras de sangue foron tomadas 5 meses despois do transplante para estimar o transplante en receptores. WBCS foron illados usando un buffer hemolítico (NH 4 0, 1 m, Nahco 3 12 m, edta 10 m m, pH 8, 0), fixado nunha solución de Carnoy (ácido de metanol-acético 3: 1) e colocado en láminas de microscopio .. As células foron tratadas con HCl 0, 1 m que contén 0, 05% Triton X-100 por 7, 5 minutos a 37 ° C, fixado no 1% de paraformaldeído buffered (pH 7, 4) por 15 minutos a 24 ° C, entón deshidratado en etanol. Leváronse a cabo as hibridacións incubando as láminas durante a noite nunha habitación humidificada a 37 ° C cunha solución (2x SSC, 50% de formamida, 10% de sulfato dextrano, 0, 1% entre 20, 0, 5 mg / ml de esperma de salmón ADN ) que contén 4 ng / μl dun rato biotinilado [M34) Sonda de sensor específica (M34) .40 Despois da hibridación, as láminas foron lavadas e desenvolvidas usando unha avidina conxugada de fluoresceína (5 μg / ml) (Sigma, St Louis, MO, EUA ), seguido da amplificación con anti-avidin biotinylated (2 μg / ml) (vector laboratorios, burlingame, CA, EUA). A continuación, realizouse unha segunda incubación / amplificación co conxugado de avidina-avidina para maximizar a sensibilidade de detección. As células foron entón contra coloridas con ioduro de propidio (100 μg / ml) (sigma) e montado nun medio anti-grove (Tris-HCl 10 mm pH 7, 5 que contén 20 mg / ml de Dabco (TrietilenDiamine – 1, 4-diazabicyclo octane; sigma) en glicerol). 300 núcleos foron marcados para determinar a porcentaxe de células derivadas do doador no sangue enxertado.

proba inmunoasorbente enzimática (ELISA) e inmunoprecipitación

Para detectar a presenza de anticorpos dirixidos contra os HPS recombinantes expresados, as doses de Elisa foron realizadas no plasma dos ratos tratados e non tratados. O Hasm purificado foi incubado durante 18 horas en placas de microtiter de 96 ben. Os pozos foron lavados 3 veces co buffer de lavado 1 (WB1, TRIS 10 mm, PH 7, 5, NACL 150 mm, entre 20 0, 05%), entón bloqueado por 1 hora con BSA a 3% en PBS a temperatura ambiente .. As dilucións de plasma do rato tratadas e non tratadas en WB1 (100 μL a unha dilución de 10 -2, 10 -3, 10 -4) foron engadidas aos pozos e incubados a 37 ° C por 3 h. Os pozos foron lavados 3 veces con WB1, a continuación, 100 μl de peroxidasa-conjugado anti-rato (sigma) (1: 500 dilución en WB1) e engadiuse unha incubación de 2 horas a temperatura ambiente. Os pozos foron de novo lavados 3 veces con WB1 e 2 veces co lavado Buffer 2 (10 mm PH 7, 5, NACL 150 mm). Un substrato de peroxidasa foi engadido ao Wells (100 pés) e incubados a temperatura ambiente durante 30 minutos. Utilizouse un lector automatizado de Plate Elisa para determinar a absorbancia a 405 Nm.

As probas de inmunoprecipitación foron utilizadas para determinar se os anticorpos presentes nos ratos tratados inactivaron a enzima expresada. Unha solución de 500 U de Hasm, 1 ml de PBS, 10 μL de plasma de rato (tratado ou indicador) e 1 mg / ml de BSA foi incubado por 18 h a 4 ° C nunha roda rotativa. A continuación, 100 μL de proteína G-sepharose diluída a 1: 1 en PBS engadiuse á solución e incubadas durante 4 horas a 4 ° C. Despois da centrifugación a 14 000 rpm por 2 min, a actividade de ASM en supernatantes e pellets foi analizado.

ASM ASM ASSAY

A esfingomenidade covalentada coa sonda fluorescente de Bodipy (Bodipy Dodecanoyle Skingosyl Fosfocholine, Bod12-SPM) foi sintetizado como anteriormente descrito para Lissamine Rhodamine Sphingomyelin (LR12- SPM) 41, con excepción do ácido cordial dodecanoico (sondas moleculares, eugene, ouro, EE. UU) condensado con fosfolina esfingosil. A escisión do DBo12-SPM pola ASM libera a ceramida fluorescente, que pode ser cuantificada despois da separación por CCM ou a extracción orgánica. Os wbcs ou os tecidos obtivéronse como anteriormente descritos18 e homoxeneizados en Triton X-100 a 0, 2% sobre xeo usando tres 10 segundos de homoxeneizador de tecido Potter-Elvehjem (Thomas Scientific, Sweedesboro, NJ, EUA). A proteína total foi determinada polo método de Stein et al.42. A mestura de ensaio estándar con 15 μL de ASM consistía en 10 μL de mostra (células homoxeneizadas ou tecidos) e 2 NMOL de DBO12-SPM suspendido no buffer de acetato de sodio 0, 1 m, PH 5, 2., que contén 0, 6% TRITON X -100 e 5 mm EDTA (para detectar a actividade de ASM dependente non zinc) ou Zncl 2 0,1 mm (para a detección da actividade L ASM estimulada por Zinc) .43 Despois da incubación da mestura de proba a 37 ° C (arriba A 3 h), as mostras foron cargadas en placas cromatografias de capa fina (TK SILICA GEL LK6 D 60, Whatman, Clifton, Nova Jersey, Estados Unidos) e resolto usando unha mestura de cloroformo / metanol (95: 5 V / V). Despois da resolución, a cinta que contén a ceramida marcada de fluorescencia foi raspada das placas CCM, extraídas nun cloroformo / metanol / auga (1: 2: 1 V / V) Mestura por 15 minutos a 55 ° C e cuantificada nun espectrofluorómetro. ( 204-Un espectrofotómetro de fluorescencia, Perkin Elmer). O instrumento foi configurado en excitación e lonxitudes de onda de emisión de 505 e 530 Nm, respectivamente.

A análise de esfingomenio

As taxas de espérito (SPM) foron determinadas a partir do contido de fosfato de cada mostra.44 Os tecidos (cerebro, fígado, pulmón e bazo) foron homoxeneizados nunha mestura de cloroformo / metanol (1: 2 V / V) para unha vista. Extracción lipídica. Unha hidrólise fosfolípíde alcalina realizouse sobre as mostras de fígado, pulmón e bazo en koh 0, 4 n / metanol ao 90% por 2 h a 55 ° C. Para evitar a interferencia de plasmolifano e outros fosfolípidos nos extractos cerebrais, realizouse unha hidrólise ácida Nestas mostras utilizando HCl 0, 6 m en etanol por 30 minutos a 37 ° C antes da hidrólise alcalina. Despois da hidrólise, as mostras foron incubadas con ácido perclórico (70%) durante 40 minutos a 180 ° C, entón tratados con Molybdate de amonio a 0, 5% e un reductor de fiske e subbraw (4 mg / ml; sigma) por 10 min en 100 ° C. A absorbancia a 830 NM foi medida nun espectrofotómetro (modelo 1201, Milton Roy Spectronic, Rochester, NY, EE. UU.).

Preparación do tecido para a histoloxía

Os ratos foron anestesiados con Ketamine (Sigma; 0, 5 g / kg de peso corporal) e suxeito a infusión cardíaca. Unha incisión foi feita no atrio dereito para permitir que o sangue flúa e unha cánula foi introducida na aorta a través do ventrículo esquerdo, entregando 50 ml de solución quente a 0, 9% NACL. As mostras de tecido para a microscopía óptica foron fixadas nun 10% de formalón buffer, incluído en parafina, cortado en corte e coloreado en hematoxilina e eosina. As mostras de SNC foron tomadas logo de infusión de glutaraldeído, postfixed en tetróxido de osmose, incrustado nun EPON, cortado en corte e coloreado con metileno azul II.

Purkinje Inmunodetection.

Os tecidos eran Corrixido por infusión vascular cun formaldeído de 4% buffered (de paraformaldeído) e 50 μm foron obtidos a partir do cerebral por vibratoma. As seccións foron tratadas con metanol / peróxido de hidróxeno para eliminar a actividade da peroxidasa endóxena, bloqueada cunha solución a un 10% de cabra normal e o 10% do suero normal, cun 1% de álbumin de albúmina, en 0, 1% de gelatina e 0, 01% de azida de sodio en PBS, seguido dun tratamento 18 h de incubación con anti-calbindina Rabbit Antiserum (Sigma) (Dilución 1: 5000 preparada no mesmo buffer). Os cortes foron entón lavados por 4 a 8 horas en PBS e incubados durante 18 horas nun inmunorreacción anti-coello diluído composto por un fragmento FAB2 conxugado á peroxidasa (alto no burro), absorbido absorbido por non reaccionar aos inmunoglobinos do rato (Amersham) .. Despois de 4 a 8 horas de lavado, os cortes foron desenvolvidos nun hidróxeno estándar, mestura de hidróxeno seco e lamellado.

análises estatísticas

Análise Kaplan – Meier Actuarial (Figura 2) levouse a cabo Usando o sistema estatístico de axudar a aprehensión e recuperación dos datos do paciente (Casper). Para os datos ilustrados nas cifras 1 e 3, os valores medios son trazados cos erros estándar da media. Os valores P calcúlanse mediante unha proba de T MAILED.

Recoñecementos

Este traballo foi financiado por subvencións de investigación do Instituto Nacional de Saúde (HD 28607 e HD 32654), de A fundación de malformacións conxénitas marcha de Dimes (1 a 2224), unha subvención (RR 0071) do Centro Nacional de Investigación do Monte Sinaí. Centro xeral de investigación clínica e unha subvención (93-00015) da fundación científica binacional estadounidense-israelí. Queremos agradecer ao Dr. Lalji Singh, o Centro de Bioloxía Molecular e Molecular (India) por proporcionar a sonda específica do cromosoma Y.

Be First to Comment

Deixa unha resposta

O teu enderezo electrónico non se publicará Os campos obrigatorios están marcados con *