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terapia genica da cellule staminali ematopoietiche Porta ad un chiaro miglioramento degli organi viscerali e dell’aspetto tardivo delle anomalie neurologiche nel modello murino della malattia di Niemann – scegli carente in sfingomielinasi acidi

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astratto

niemann – pick (NDP) tipo Le malattie del tipo A e B risultano dall’attività carente di sphingomyelinasi acido (ASM). Attualmente, nessun trattamento è disponibile per una o l’altra forma di NDP. Usando il modello del mouse ASM Knockout, abbiamo valutato gli effetti della terapia del gene delle cellule staminali ad ematopoietiche ex vivo sul fenotipo NDP. Trentadue topi Asmko neonati sono stati precondizionati con la bassa radiazione della dose (200 cgy) e trapiantata con le cellule del midollo osseo ASMKO che sono state trasdotte con una codifica vettoriale retrovirale ecotropica per l’ASM umano. Il trapianto di cellule derivato da donatori variava dal 15 al 60% sulla base dell’analisi di ibridazione in situ sui globuli di globuli bianchi periferici ed è stato effettuato nel 92% degli animali innesti. Alti livelli di attività ASM (fino a cinque volte superiore al normale) sono stati trovati negli animali innestati fino a 10 mesi dopo il trapianto e la durata della vita è stato esteso in media da 5 a 9 mesi dalla procedura di terapia genica. Le analisi biochimiche e istologiche dei tessuti ottenuti da 4 a 5 mesi dopo il trapianto hanno mostrato un aumento delle attività ASM e una significativa riduzione dello stoccaggio di sphingomyelin nella milza, fegato e polmoni trattati topi trattati, principali siti patologici del tipo NDP B. Anche la presenza di neuroni cellulari Purkinje è stata notevolmente aumentata nel gruppo trattata rispetto agli animali non elaborati 5 mesi dopo il trapianto, e una riduzione della memoria dei neuroni del midollo spinale è stata osservata. Tuttavia, tutti i topi innesti hanno finito per lo sviluppo di un atassia e sono morti prima dei topi normali. Complessivamente, questi risultati indicano che la terapia germinale del gambo ematopoietico dovrebbe essere efficace per il trattamento del tipo NDP non neurologico B, ma quella miglioramento delle tecniche per la miratura di cellule innesti e / o l’enzima espresso su specifici siti patologici. Il sistema nervoso centrale deve essere migliorato. Sviluppato per ottenere un trattamento efficace di un tipo NDP.

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Introduzione

niemann – Pick (NPD) La malattia di tipo A e B sono due clinicamente distinti Forme di un disturbo di stoccaggio lisosomico causato dalla carenza ereditaria nella sfingomielina dell’acido (ASM; CE 3.1.2.12). Attività.123 Digitare un NDP si manifesta da un ritardo dello sviluppo, un epatosplenomegalia e un’evoluzione neurodegenerativa rapida progressiva che porta generalmente alla morte a 3 anni. D’altra parte, il tipo B NDP è caratterizzato da epatosplenomegalia, infiltrats polmonare che porta a frequenti infezioni respiratorie, coinvolgimento neurologico minimo o zero e sopravvivenza adolescente o adulta. Spingomyelin e colesterolo si accumulano in pazienti con i due fenotipi NDP, ma i meccanismi fisiotopatologici specifici alla base della loro distinta evoluzione clinica rimangono sconosciuti.

Negli ultimi anni, il cDNA e i geni umani e murini sono stati isolati ed espressi, 4567 Le mutazioni che causano malattie sono state identificate8 e i modelli murini inattivibili sono stati prodotti910. Le caratteristiche cliniche, biochimiche e patologiche del carente in ASM (Asmko topi) imitano il tipo umano A e B NDP di tipo A e B, offrendo così la possibilità di ottenere nuove informazioni sulla patogenesi della malattia e sviluppare e valutare nuovi approcci terapeutici.

Attualmente, nessuna elaborazione è disponibile per una o l’altra forma di NDP. Il trapianto dell’epatico in un uomo con NPD tipo A è stato infruttuoso 1112 e, sebbene siano stati segnalati test del trapianto di membrana amniotica dell’osso e dei trapianto del midollo osseo, 13141516, è stato studiato solo un piccolo numero di pazientii umani.

contrario a Questi studi nell’uomo, un’analisi completa del BMT è stata effettuata nel mouse ASMKO1718. Questa tecnica ha portato a un miglioramento della vita, nei miglioramenti istologici e biochimici di diversi organi clinicamente importanti, compreso il fegato e la milza e una comparsa di fenotipo neurologico.Pertanto, l’uso di BMT Allogeneic per il trattamento del tipo B NDP è fondato scientificamente, ma è complicato dalla mancanza di donatori fratelli e sorelle pienamente compatibili nella maggior parte delle famiglie NDP, della morbilità e della mortalità associata all’uso del totale irradiazione del corpo e reagenti immunosoppressivi., così come la malattia dell’innesto contro l’host (GVHD).

L’innesto autologo delle cellule del midollo osseo geneticamente modificato (terapia genica da cellule staminali ematopoietiche, HSCGT) è quindi una ragionevole alternativa al TMO allogenico per il trattamento di questa malattia.19 Elimina i due principali problemi del donatore e della disponibilità di GVHD, portando teoricamente a una diminuzione della morbilità e della mortalità. Inoltre, le cellule corrette enzimatiche ottenute dal trasferimento genico possono esprimere / secernere l’enzima a livelli maggiori di quelli trovati in cellule normali, magari che portano a migliorare l’efficienza clinica.

Esperimenti. Descritto in questo manoscritto è stato intrapreso Per valutare se il trapianto di bassa dose con le cellule ematopoietiche della trasduzione retrovirale potesse essere eseguita a lungo termine, e se il trapianto di queste cellule nei topi neonati ASMKO potrebbe avere effetti terapeutici. Inoltre, abbiamo confrontato l’efficacia di questo approccio terapeutico con i risultati precedentemente ottenuti dal trapianto di normali cellule del midollo osseo (cioè BMT).

Trapianto e innesto

Trentadue Asmko I topi appena nati (di 2 giorni di età) sono stati trapiantati con 1 × 10 6 celle di midollo osseo trasdotto con un vettore retroviral asm / mfg ecotrop (vedere materiali e metodi per ulteriori dettagli). L’irradiazione totale del corpo di Succetale (200 cgy) è stata utilizzata per facilitare il trapianto con le cellule dei donatori maschili, in modo che i livelli di presa del trapianto possano essere valutati nei destinatari mediante l’ibridazione in situ utilizzando una sonda specifica del cromosoma Y17. Cinque mesi dopo il trapianto, il WBC dai donatori è stato rilevato nel 92% delle femmine trapiantate e la percentuale di queste cellule (cioè innesto) variava tra il 15 e il 60%, la percentuale di presa innestata leggermente inferiore a quella precedente ottenuta da BMT17. Tutti gli animali innesti erano determinati ad essere positivi per la presenza di sequenze vettoriali nei loro globuli bianchi periferici 3 e 8 mesi dopo l’innesto utilizzando un metodo di schermatura PCR (non presentato).

Attività ASM nel WBC di Asmko Mouse innestato

Le attività ASM WBC sono state misurate mensilmente in singoli animali dopo la procedura di trapianto. Come mostrato nella Figura 1, i topi trattati Asmko avevano attività ASM significativamente più elevate rispetto ai loro intervalli normali (P < 0, 002). I topi asmko non trattati hanno < 1% della normale ASM Attività WBC.9 A partire da 1 mese e fino al quinto mese dopo il trapianto, i livelli di attività dell’attività ASM del WBC in trattati Gli animali aumentano gradualmente e si sono stabilizzati in seguito. Tuttavia, nessuna correlazione diretta tra l’ASM Attività WBC e la sopravvivenza (vedere la figura 2 di seguito) è stata osservata durante l’analisi degli animali.

ASM Attività nel WBC Trattato Asmko e Control Animals. I campioni di sangue dell’orbita retinica sono stati presi ogni mese dopo il trapianto e i saggi di attività ASM sono stati eseguiti su WBC, come descritto in materiali e metodi. Il grafico mostra i valori medi e gli errori standard dei topi normali medi (▪), ASMKO (•) e ASMKO () trapiantati. N = 32 per Asmko innestato e cinque per animali di controllo normali e ASMKO sottoposti a irradiazione. Si noti che gli animali di controllo asmko non trattati sono sopravvissuti solo fino all’età di 6 mesi di età.

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Kaplan – Meier Diagram che mostra una maggiore sopravvivenza dei topi Asmko inviati a HSCGT. Normale (▪), Asmko (•) e Asmko trapiantato ().

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I campioni di siero del mouse iniettati sono stati analizzati da ELISA per la presenza di anticorpi anti-hasm e immunoprecipitazione a determinare se questi anticorpi hanno disattivato l’attività enzimatica. Tutti gli animali innesti con successo avevano livelli misurabili di anticorpi anti-hasm nel loro plasma, ma in tutti i casi questi anticorpi non inibiscono l’attività ASM immunoprecipitata (cioè, non sono state neutralizzanti, non rappresentate).

Sopravvivenza e crescita dei topi Asmko innestati

Gli effetti della procedura di terapia genica sulla sopravvivenza dei topi Asmko sono dimostrati nell’analisi Kaplan-Meier mostrata nella figura 2. La vita di Gli animali testimoniano l’irradiazione di tipo selvaggio (cioè irradiato ma non trapiantato) era normale (> 1 anno). ), mentre tutti i topi Asmko sottoposti al controllo di irradiazione sono morti tra 6 e 7 mesi (età media alla morte 6, 4 mesi). L’aumento della longevità è stata osservata negli animali trattati con la terapia genica. Ad esempio, a 8 mesi dopo il trapianto, circa il 75% degli animali trattati ASMKO è sopravvissuto, mentre 10 mesi dopo il trapianto, questo numero è stato ridotto al 40%. Tuttavia, nonostante la loro maggiore durata, l’atassia è diventata evidente nei topi trapiantati intorno ai 6 mesi e tutti gli animali trattati (ad eccezione di coloro che sono stati messi a morte prematuramente per scopi sperimentali) alla fine sono morti all’età di 1 anno . Prima dei 6 mesi, i regimi di trattamento del gruppo di trattamento erano simili a quelli del normale gruppo di controllo, ma poi hanno perso peso e hanno seguito un’evoluzione neurodegenerativa simile a quella dei topi Asmko. Pertanto, la procedura di terapia genica ha ritardato la comparsa dei sintomi neurologici, ma non li ha fermati.

ASM Attività e sfingomyelin contenuto negli organi

cinque mesi dopo il trattamento, un gruppo di Sei animali innesti (oltre a tre animali di controllo normali e affetti) sono stati messi a morte e infusi con soluzione salina per prelevare il sangue dagli organi. I fegati, i ratti, i polmoni, i reni, i cuori e il cervello furono poi sezionati e congelati. I livelli ASM di attività e il contenuto di sphingomyineline sono stati valutati in questi organi e i risultati sono riportati in figura 3. Va notato che i livelli di attività ASM nella milza, il fegato e i polmoni degli animali Asmko trattati erano trattati circa 90, 65 e 40%. di normalità, rispettivamente, significativamente sopra i valori trovati negli animali Asmko non trattati.9 (il valore di P durante il confronto delle attività ASM in questi tessuti tra i topi trattati e non trattati ASMKO MICE era < 0, 0001.) D’altra parte, i livelli di attività ASM trovati nel cervello, i cuori e i reni degli animali trattati non erano più statisticamente di quelli trovati negli animali non trattati (valori di P > 0, 1).

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ASM ATTIVITÀ E CONTENZIONE SPHONGOMELINELINELINELICE IN TESSUSE ASMKO E ANIMALI DI CONTROLLO TRATTATO. a) cinque mesi dopo il trapianto, le attività ASM sono state misurate in diversi organi, come descritto in materiali e metodi. L’istogramma mostra un confronto tra le attività medie ASM negli animali trattati (N = 6) con le attività rilevate negli stessi tessuti del mouse di controllo normali e invecchiato (n = 3). Le linee verticali indicano l’errore standard della media. (b) I livelli di sphingomyelin sono stati misurati negli stessi tessuti come gli animali trattati e sono rappresentati dalla percentuale di riduzione rispetto agli animali di controllo ASMKO non trattati della stessa età (n = 3).

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In modo significativo, è stata osservata una significativa correlazione tra i livelli di enzima e la liquidazione del substrato. Infatti, nei ratti e sui fegati, dove le attività ASM erano significativamente elevate, l’accumulo di sfingomielinico è stato ridotto a livelli quasi normali (il valore di P quando il confronto del contenuto di sphingomyine di questi tessuti tra i topi trattati e normali di ASMKO era > 0, 1). Una situazione intermedia è stata osservata nei polmoni, mentre nel cervello, nei cuori e nei reni, non c’era praticamente un’attività rilevabile di ASM o riducendo la sfingomielina.

Effetti patologici

La figura 4 mostra Un’analisi istologica rappresentante di tagli di tessuto di fegato, polmoni e ratti di indicatori di controllo del mouse e irradiazione trattati (Asmko e normali) 5 mesi dopo il trapianto. Si noti che circa i 5 mesi, i topi non trattati Asmko (f) hanno avuto un importante deposito lipidico rispetto agli animali normali (pannelli A – c). Molte cellule schiumogene pallide sono state disseminate nelle sezioni del fegato e della milza e una significativa infiltrazione di alveoli e setti è stato osservato nei polmoni, ostacolando il tratto respiratorio. In particolare, i tessuti degli animali trattati (pannelli G – I) mostrano un accumulo di lipidi significativamente inferiori a quelli degli animali di controllo asmko non trattati.In Fig. 5, una riduzione del materiale di stoccaggio nel midollo spinale degli animali trattati è mostrata da un colore blu azzurro II-metilene.

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Istologia non snc. Colorazione con ematossilina-eosina di fegato, polmone e milzaggio dei controlli normali rappresentativi (A – c), controllo ASMKO (D – F) e Asmko topi (G – I) trattati 5 mesi dopo il trapianto (ingrandimento iniziale × 200).

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Istologia del midollo spinale. Asmko Mouse Spinal Conds Asmko (A) invecchiato 5 mesi e mouse Asmko (B) trapiantato. Le frecce indicano granuli altamente basofili nel citoplasma del mouse del mouse Asmko. Nota la riduzione di questo materiale in animali trapiantati.

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Per studiare gli effetti dell’HSCGT sulla perdita di cellule PUKINJE (PC) che si verifica nei topi Asmko Abbiamo confrontato le sezioni cerebrali controllate e trattate (trapianto di 5 mesi) immunoreagi con un antiserma di calbindiano, una proteina legante di calcio espressa esclusivamente in PC (figura 6). ) Notare la perdita di PC contrassegnata in un controllo ASMKO non trattato (Panel A) rispetto a una sezione Rappresentante di un mouse trattato (Pannello B). Infatti, un singolo lobo cerebellum mostra una colorazione del PC nell’animale Asmko non trattata, mentre i PC sono presenti in tutti i topi trattati del cervello e dai normali topi di controllo dell’irradiazione. Questa figura mostra anche che la procedura di irradiazione subtowal (200 cgy) utilizzata per facilitare il trapianto di celle del trapianto non ha compromesso lo sviluppo e la distribuzione dei PC nel normale animale Cerebel.

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Immunoistochimica delle cellule Purkinje. Taglio sagittale di Asmko (A) invecchiato 5 mesi, trapiantato Asmko (B) e normale controllo di irradiazione (c) Cerebella. Si noti che le cellule Purkinje sono presenti in un’estensione molto più lunga del cervelletto del mouse trattato con topi non trattati.

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Discussione

Lo scopo di questo Lo studio era di determinare se l’HSCGT potrebbe essere un approccio terapeutico efficace per NDP di tipo A e / o B. Il modello del mouse NPD (ASMKO) ha una patologia del sistema nervoso centrale e viscerale. Molto simile a quello dei pazienti con NDP umano, e è un sistema eccellente per valutare questa strategia terapeutica e altri. In precedenza abbiamo riportato i risultati di BMT in Asmt Mice, 1718, e scopriva che un regime di precondizionamento subletal in animali neonai potrebbe comportare un trapianto di alto livello senza crescente mortalità o artefatti patologici. Inoltre, abbiamo dimostrato un’alterazione significativa ma incompleta del fenotipo nei topi trattati. In particolare, il fenotipo istologico è stato significativamente migliorato negli organi reticoli-endoteliali e il verificarsi di atassia è stato ritardato (allo stesso tempo di una maggiore ritenzione di pc neuroni), ma tutti gli animali trattati hanno finalmente sviluppato sintomi neurologici. E morì prematuramente .

L’HSCGT ha diversi potenziali vantaggi rispetto al BMT in pazienti con NDP umano, incluso il fatto che le cellule del trapianto non devono necessariamente derivare dai donatori normali o eterozigoti compatibili con HLA. Inoltre, le cellule autologhe trasdotte possono potenzialmente sovraesprimere il transgene, forse con una maggiore risposta terapeutica. In questo studio, le attività ASM WBC sono state ottenute superiori ai normali da diversi animali trattati durante il periodo di approvazione di 10 mesi. E scoperte biochimiche in organi viscerali e neurodegenerazione ritardata, tutti i topi trapiantati hanno finalmente sviluppato un atassia e sono morti prematuramente.

Va notato che le tariffe di innesto ottenute dal protocollo della terapia genica. Come determinato dall’ibridazione in situ Con una sonda specifica del cromosoma Y, erano inferiori a quelle ottenute da BMT17, nonostante il fatto che la procedura di trapianto (ad esempio il numero di cellule, irradiazioni) dose) fosse la stessa. Questi risultati evidenziano diverse importanti differenze tra i due approcci terapeutici.Ad esempio, durante il normale trapianto del midollo osseo, non è stata eseguita alcuna gestione cellulare, cioè il contenuto totale delle cellule del midollo osseo prelevate dalle normali ossa dei donatori è stata trapiantata senza coltivazione cellulare o divisione. Nel protocollo di terapia genica, una popolazione di cellule mononucleate, isolata mediante centrifugazione discontinua con gradiente di densità, è stata mantenuta in coltivazione per 2 giorni in presenza di fattori di crescita e trasdotto con il vettore retrovirale. Questo può spiegare i livelli più bassi dell’innesto osservato.2021

Tuttavia, nonostante un trapianto inferiore, i livelli più elevati di attività enzimatica sono stati generalmente rilevati negli organi GBS e organo trattati con la terapia. Genio rispetto a quelli che ricevono a TMO. Questi dati sono coerenti con quelli di altri ricercatori che hanno mostrato un’espressione a lungo termine ed elevate di transgeni in topi o ratti innestati con cellule ematopoietiche trasdotte da MFG.222324 in conformità con l’elevata espressione enzimatica, una correzione quasi completa. Di reticolo- Sistema endoteliale La patologia del sistema, che è stata osservata solo quando il trapianto del trapianto del trapianto ha permesso di ottenere un trapianto di alto livello (vale a dire > 90%) 18, negli animali Trattato con terapia genica innestata al 30% o meno.

La perdita dei neuroni PC nel mouse NPD Cerebel può è una delle principali caratteristiche della loro patologia di SNC91825. È anche la probabile causa di atassia progressiva, che finalmente porta alla morte. È stato riferito che i ceramidi erano un fattore critico nella sopravvivenza dei neuroni del PC Cerebelan.26 L’inibizione della sintesi ceramide causava una diminuzione della sopravvivenza cellulare, accompagnata da un’induzione della morte cellulare apoptotica e di una differenziazione dritica aberrante dei PC, senza modifiche rilevabili di altre lesioni cerebellare. Neuroni.26 D’altra parte, durante l’esposizione alla sfingomielinasi batterica, la sopravvivenza e la filiale dendritica del PC sono aumentati, probabilmente a causa della maggiore produzione di ceramidi. Per monitorare la perdita dei neuroni PC nel cervello degli animali trattati con Asmko, abbiamo eseguito un immunoistochimica con un antiserma con calbindia. Calbindine D28K appartiene alla grande famiglia di EF della famiglia, dovrebbe funzionare, in parte, come un buffer calcico citosolico. Codifica una proteina vincolante del calcio espressa nel cerebellum esclusivamente in PC.272829. Mese dopo il trapianto, c’è stato un aumento del numero di PC nei topi trattati con topi di controllo irradiati interessati. Questi risultati sono stati probabilmente dovuti a causa della presenza nella SNC delle cellule Microgly derivate dal midollo osseo e trasdotto da mezzi retrovirali in grado di secrezione di msas in quantità sufficienti per ritardare la morte cellulare specifica della malattia nei neuroni del PC. I risultati simili sono stati osservati nei nostri studi su BMT.18 è anche interessante notare che questi risultati sono stati ottenuti nonostante il fatto che nessun aumento rilevabile dell’attività ASM non può essere visto in omogenati cerebrali. Animali trattati. Questo risultato è coerente con il fatto che pochissime cellule derivate del donatore sono state in grado di attraversare la barriera del cerebrale del sangue dopo l’irradiazione subletale e un trapianto 17, e indicare che i livelli molto bassi di MSA sono sufficienti per ritardare la morte del CP. , senza avvertirli.

Sì, come il BMT Allogeneic, l’HSCGT appare come un’opzione terapeutica valida per il tipo NPD B. È particolarmente notevole che gli effetti istologici / clinici equivalenti siano stati ottenuti al momento Le procedure BMT e HSCGT, nonostante il fatto che i livelli di innesto inferiori siano stati ottenuti da loro. Questo risultato, associato al fatto che la necessità di imballaggi immunosoppressivi è considerevolmente ridotta durante il trapianto di cellule autologhe rispetto alle cellule allogeniche, rafforza l’idea che l’HSCGT possa costituire un trattamento appropriato per i pazienti NPD tipo B umano. Tuttavia, si deve notare che, nonostante questi risultati incoraggianti nel modello murino, ottenendo gli stessi risultati nei pazientii umani è ora problematico perché i vettori del trasferimento genico attualmente disponibili non sono in grado di tradurre efficacemente cellule staminali ematopoietiche e efficientemente umane. Pertanto, il BMT allogenico rimane l’unica opzione terapeutica disponibile per le persone con NPD tipo B.Per quanto riguarda il tipo A NDP, i dati indicano che i bassi livelli di espressione dell’ASM nel CNS possono portare a miglioramenti neurologici parziali, ma è improbabile che, come il BMT, impedisce l’evoluzione rapida e neurodegenerativa di questa malattia. Pertanto, i nuovi approcci devono essere sviluppati per migliorare la distribuzione delle cellule trapiantate nel CNS e / o aumentare l’espressione dell’ASM derivato dal vettore nel cervello del tipo NPD A per un trattamento efficace. P.>

Retroviral Costruzione di vettore e preparazione di cellule produttrici anfotropiche

Il vettore retrovirale ASM / MFG è stato costruito inserendo il cDNA ASM umano a figura intera (haSM) nel vettore MFG come descritto in precedenza .30 In breve, PCR La mutagenesi è stata utilizzata per introdurre un sito di restrizione NCOL nel codone di iniziazione della traduzione del tipo di Hasm natura per ottimizzare la traduzione e facilitare la clonazione. Per generare linee cellulari retrovirali anfotoropi, il vettore ASM / MFG è stato co-elettroporato con Psv2neo plasmid in celle di imballaggio anfotropiche EnVam1231 e sottoposte a una selezione di G418. Gli ambienti sono stati raccolti da singoli cloni di cellule produttrici virali e il clone del produttore che porta alla più alta attività ASM dopo la trasduzione delle cellule NIH-3T3 è stata utilizzata per i successivi esperimenti. Il titolo del clone del produttore è stato stimato misurando l’aumento dell’attività ASM ottenuta dopo la trasduzione delle celle NIH-3T3 con diluizioni seriali del centro delle cellule produttrici, nonché da Southern Blot. Metodi simili per stimare i titoli basati sull’attività enzimatica sono stati pubblicati per diversi altri vettori MFG in assenza di un sistema di marker selezionabile.3233

Preparazione di cellule produttrici ecotropiche

per preparare ECO –Producing Cells, la linea di cellule produttrici di produzione anfotropica con il titolo più alto è stata coltivata in confluenza di circa l’80% nell’ambiente aquila modificato di Dulbecco (DMEM, GIBCOBRL, GATHersburg, MD, Stati Uniti) contenente il 20% di vitello fetale siero e antibiotici. Dopo 24 ore, il mezzo è stato raccolto, concentrato con 300 K Pall Filtron Corporation, East Hills, NY, Stati Uniti), combinati con un mezzo fresco contenente antibiotici e polibere. 8 μg / ml (Sigma, St Louis, Mo, Stati Uniti) . Il processo è stato ripetuto tre volte in un periodo di 3 giorni, quindi le cellule produttrici ecozionali trasdotte sono state raccolte e diluite in una concentrazione finale di 100 celle al giorno. 10 ml per la successiva replica e clonazione. Il DNA è stato preparato dai singoli cloni cellulari ecotropici e sottoposti a PCR quantitative (vedi sotto), e il clone con il maggior numero di copie di provirus è stato mantenuto e utilizzato per la trasduzione delle cellule. Asmko Marow Bone.

Preparazione di cellule donatori

La colonia del mouse ASMKO è stata stabilita da coppie riproduttive eterozigote ottenute dal targeting genetico delle cellule staminali embrionali 129 / sv e dalla microiniezione in c57bl / 6.9 Blastocisti Asmko topi (da 8 a 12 anni settimane) sono stati utilizzati come fonte di cellule donatori. Per ottenere cellule midollo ossea nucleate, gli animali donatori sono stati pretrattati con 5FU (150 mg / kg) 48 ore prima della morte dalla dislocazione cervicale. Le cellule del midollo osseo sono state raccolte dalle tibosità e dai femori risciacquando le cavità spinali con una soluzione di Hank tamponata (10 μmol / ml HePes, pH 7, 5) e un ago da 27 calibro. Le sospensioni monocellulari sono state ottenute passando le cellule attraverso un 40 Sieve cella di nylon μm (BETTON DICKINSON Labware, Franklin Lakes, NJ, USA). Le cellule del midollo osseo a bassa densità (< 1, 085 g / cm 3) sono state isolate mediante centrifugazione del gradiente di densità discontinua usando Nycoprep (Nycomed Pharma AS, Oslo, Norvegia) 35 e lavato con una soluzione di hank tamponati contenenti siero di vitello fetale fetale a calore al 5%. Le celle sono state quindi contati, diluite con la concentrazione desiderata e trasdotta retrovitalmente come descritto di seguito.

Transduzione retrovirale delle cellule del midollo osseo

I sundananti di virus ecozionali sono stati concentrati utilizzando tubi di filtro MacRosep 300K Secondo le istruzioni del produttore.Per raggiungere la trasduzione retrovirale, circa 1 x celle di midollo osseo IO9 dei donatori maschili Asmko sono stati coltivati per 48 ore in 10 ml di DMEM contenenti il fluido Ecotrope / MFG Ecotope Retroviral Vector, siero di vitello fetale del 20% inattivato dal calore e dagli antibiotici. Le culture contenevano anche il CSF (50 ng / ml), IL-3 (20 ng / ml), IL-6 (10 NG / ML) (Genzyme, Cambridge, MA, USA) e 8 μg / ml di polibrene.36373839. Durante le prime 24 ore, l’ambiente è stato sostituito da un mezzo fresco contenente il virus recentemente raccolto e concentrato, i fattori di crescita freschi e il polybrew.

analisi PCR per rilevare il vettore ASM / MFG

Un cambiamento nella nostra procedura descritta in precedenza è stato utilizzato.30 MWG Endogenous e MFG Sequenze endogene endogene endogeni sono state amplificate utilizzando un primer di buon senso, Exon 3 ‘TGCTGAGGGAGGGGAGA CAA -3′ (P1), costruito da ASM umani e Murin Exon 3 e due primer antisense specifici per specie, 5’-gggtaggtgacagagattga-3 ‘(P2) e 5′-ggcacaagagagagcag-3’ (P3), costruiti rispettivamente dal mouse e dall’intron umano ASM umano ASM, rispettivamente. Le coppie di primer P1 e P2 hanno amplificato uno specifico prodotto genomico genomico murino di 211 PB, mentre le coppie PL e P3 Primer hanno amplificato un prodotto 554 BP dal vettore MFG specifico dell’uomo. Ogni reazione di amplificazione (circa 100 μl di volume finale) conteneva 200 PMOL di Primer P1, 100 PMOL Primer P2 e P3, 300 NG DNA genomico DNA, 1x tampone PCR, 1, 5 mm di MGCL 2, 5U Polymerase taq (Promega, Madison, Wi, USA) e 200 m m ciascuno di DNTP. Una curva standard è stata generata utilizzando miscele di DNA come descritto. 20 Dopo l’amplificazione (30 cicli, ciascuno comprendente 1 minuto a 93 ° C, 61 ° C e 72 ° C), i prodotti di PCR sono stati separati da elettroforesi su una soluzione di agarosio a 1, 5%. Gel e colorati con bromuro di etidium. L’intensità dei nastri è stata determinata utilizzando il pacchetto software NIH Imager.

Trapianto trapianto trapianto Trapianto

Trentadue Tholes-Due 2 giorni Asmko Mouse sono stati utilizzati come ricevitori. Prima di ricevere il trapianto, i destinatari sono stati sottoposti a una singola dose di irradiazione totale del corpo di 200 cgy da una doppia fonte di 137 cs (tasso di dose, 80 cgy / min). Ogni animale ha ricevuto un totale di 1 × 10 6 celle / peso corpo corpo iniettato per via endovenosa. I compagni di rifiuti della stessa età (normale e Asmko, n = 5 per ciascuno) sono stati utilizzati come indicatori di irradiazione (cioè irradiati, ma non trapiantati). Gli animali sono stati mantenuti secondo un ciclo leggero / scuro di 12 ore, acqua a volontà e purina per i roditori Purina 5001. Nessun antibiotico o altro trattamento di supporto è stato somministrato a nessuno degli animali prima o dopo il trapianto.

Valutazione post-innesto

I pesi degli animali e dei cookie trapiantati sono stati registrati mensilmente. Il sangue periferico è stato ottenuto anche dal sanguinamento dell’orbita retinica per un’analisi mensile degli enzimi in globuli bianchi (WBC) (vedi sotto).

in situ Ibridazione del cromosoma y

I campioni di sangue sono stati presi 5 mesi dopo il trapianto di stimare il trapianto dei ricevitori. Le WBC sono state isolate utilizzando un buffer emolitico (NH 4 0, 1 m, nahco 3 12 m, EDTA 10 m m, pH 8, 0), fissato in una soluzione Carnoy (acido metanolo-acetico 3: 1) e posizionato sulle lame del microscopio . Le cellule sono state trattate con HCL 0, 1 m contenente 0, 05% Triton X-100 per 7, 5 minuti a 37 ° C, fissato in paraformaldeide tamponata all’1% (PH 7, 4) per 15 minuti a 24 ° C, quindi disidratato in etanolo. Gli ibrida sono stati effettuati incubattendo le lame durante la notte in una sala umidificata a 37 ° C con una soluzione (2x SSC, formamide del 50%, solfato di Destran del 10%, 0, 1% di 20, 0, 5 mg / ml di DNA dello sperma del salmone ) contenente 4 ng / μl di una sonda del sensore specifica del mouse biotinilato [M34) (M34) .40 Dopo l’ibridazione, le lame sono state lavate e sviluppate utilizzando una fluoresceina coniugata avidina (5 μg / ml) (Sigma, St Louis, Mo, USA ), seguito dall’amplificazione con anti-avidina biotinilata (2 μg / ml) (laboratori vettoriali, Burlingame, CA, USA). Quindi, è stata eseguita una seconda incubazione / amplificazione con il coniugato di fluorescein-Avidine per massimizzare la sensibilità di rilevamento. Le celle sono state quindi contro-colorate con ioduro di propidio (100 μg / ml) (Sigma) e montati in un mezzo anti-Grove (Tris-HCL 10 mm pH 7, 5 contenente 20 mg / ml di dabco (trietilenediammina– 1, 4-diazabicyclo ottano; sigma) in glicerolo). Sono stati segnati 300 nuclei per determinare la percentuale di cellule derivate da donatori nel sangue innestato.

Test immunoassorbente enzimatico (ELISA) e immunoprecipitazione

Al fine di rilevare la presenza di anticorpi diretti contro l’HP ricombinante espresso, i dosaggi ELISA sono stati eseguiti sul plasma da topi trattati e non trattati. L’hasm purificato è stato incubato per 18 ore in piastre di microtitozione di 96 pozzetti. I pozzetti sono stati lavati 3 volte con il tampone di lavaggio 1 (WB1, TRIS 10 mm, PH 7, 5, NACL 150 mm, Tween 20 0, 05%), quindi bloccato per 1 ora con BSA al 3% in PBS a temperatura ambiente . Le diluizioni plasmatiche del mouse trattate e non trattate in WB1 (100 μl a una diluizione di 10 -2, 10 -3, 10 -4) sono stati aggiunti ai pozzi e incubati a 37 ° C per 3 h. I pozzetti sono stati lavati 3 volte con WB1, quindi 100 μl di anti-mouse di capra coniugata di perossidasi (Sigma) (diluizione 1: 500 in WB1) e un’incubazione di 2 ore a temperatura ambiente è stata aggiunta alla temperatura ambiente. I pozzetti sono stati nuovamente lavati 3 volte con WB1 e 2 volte con il tampone di lavaggio 2 (pH 7, 5, NACL 150 mm). Un substrato di perossidasi è stato quindi aggiunto ai pozzi (100 ft) e incubati a temperatura ambiente per 30 minuti. Un lettore automatico della piastra ELISA è stato utilizzato per determinare l’assorbanza a 405 nm.

I test di immunoprecipitazione sono stati utilizzati per determinare se gli anticorpi presenti nei topi trattati hanno inattivato l’enzima espresso. Una soluzione di 500 U di Hasm, 1 ml di PBS, 10 μl di plasma del mouse (trattati o indicatori) e 1 mg / ml di BSA è stato incubato per 18 ore a 4 ° C su una ruota rotante. Successivamente, 100 μl di proteine G-Sepharose diluita a 1: 1 in PBS sono stati aggiunti alla soluzione e incubati per 4 ore a 4 ° C. Dopo la centrifugazione a 14.000 giri / min per 2 minuti, l’attività di ASM in Supernatants e Pellet erano analizzato.

ASM ATTIVITÀ ASSAY

La sfingyeline covalented con la sonda fluorescente bodipy (bodipy dodecanoyle sphingosyl fosphocholine, BOD12-SPM) è stata sintetizzata come precedentemente descritta per la sfingomielina della Rhodamine di Lissamine (LR12- SPM) 41, ad eccezione dell’acido del bodipy dodecanoico (sonde molecolari, Eugene, Gold, USA) condensate con sfingosil fosfocholina. La scollatura del DBO12-SPM dall’Asm rilascia ceramide fluorescente, che può essere quantificata dopo la separazione da parte di ccm o estrazione organica. I WBC o i tessuti sono stati ottenuti come precedentemente descritto18 e omogeneizzato in Triton X-100 a 0, 2% su ghiaccio utilizzando tre 10 secondi di un omogeneizzatore di tessuto Potter-Elvehjem (Thomas Scientific, Sweedesboro, NJ, USA). La proteina totale è stata determinata dal metodo di Stein et al.42. La miscela del saggio standard con ASM 15 μl consisteva in 10 μl di campione (cellule o tessuti omogeneizzati) e 2 Nmol di DBO12-SPM sospeso nel buffer acetato di sodio 0, 1 m, pH 5, 2., contenente 0, 6% tritone x -100 e 5 mm EDTA (per rilevare l’attività di ASM non-zinco-dipendente) o ZNCL 2 0,1 mm (per il rilevamento dell’attività ASM di L stimolata da zinco) .43 dopo l’incubazione della miscela di prova a 37 ° C (in alto A 3 ore), i campioni sono stati caricati su piatti di cromatografia a strati sottili (TK Silice Gel LK6 D 60, Whatman, Clifton, New Jersey, Stati Uniti) e risolto utilizzando una miscela di cloroformio / metanolo (95: 5 V / V). Dopo la risoluzione, il nastro contenente la ceramide contrassegnata dalla fluorescenza è stato raschiato dalle piastre CCM, estratti in un cloroformio / metanolo / acqua (1: 2: 1 V / V) miscela per 15 minuti a 55 ° C e quantificati in uno spettrofluorometro. ( 204-Un spettrofotometro a fluorescenza, Perkin Elmer). Lo strumento è stato impostato sulle lunghezze d’onda di eccitazione e delle emissioni di 505 e 530 Nm, rispettivamente.

Analisi SphingMyeline

Spessyeline Tassi (SPM) sono stati determinati dal contenuto fosfato di ciascun campione.44 I tessuti (cervello, fegato, polmonare e milzan) erano omogeneizzati in una miscela di cloroformio / metanolo (1: 2 V / V) per una vista. Estrazione lipidica. Un’idrolisi fosfolipidica alcalina è stata effettuata su campioni di fegato, polmonare e milzaggio in Koh 0, 4 N / metanolo al 90% per 2 ore a 55 ° C. Per evitare interferenze plasmolifane e altri fosfolipidi negli estratti cerebrali, è stata eseguita un’idrolisi acida Su questi campioni utilizzando HCL 0, 6 m in etanolo per 30 minuti a 37 ° C prima dell’idrolisi alcalina. Dopo l’idrolisi, i campioni sono stati incubati con acido perclorico (70%) per 40 minuti a 180 ° C, quindi trattato con Molybdate di ammonio a 0, 5% e un riduttore del fiske e del sottobosco (4 mg / ml; sigma) per 10 minuti a 100 ° C. L’assorbanza a 830 Nm è stata misurata in uno spettrofotometro (modello 1201, Milton Roy Spectronic, Rochester, NY, USA).

Preparazione del tessuto per istologia

I topi sono stati anestetizzati con ketamina (Sigma; 0, 5 g / kg di peso corporeo) e soggetto a infusione cardiaca. Un’incisione è stata fatta nell’atrio destro per consentire al sangue di fluire e una cannula è stata introdotta nell’aorta attraverso il ventricolo sinistro, offrendo 50 ml di una soluzione calda a 0, 9% nacl. I campioni di tessuto per la microscopia ottica sono stati fissati nel 10% formalallo bufferol, incluso in paraffina, tagliato a taglio e colorato a ematossilina ed eosina. I campioni SNC sono stati presi dopo l’infusione di Glutaraldeide, postixed in tetroxide dell’osmosi, incrostato in un’epona, tagliato a taglio e colorato con metilene blu II.

immunodetezione cellulare Purkinje.

I tessuti erano Risolto con infusione vascolare con formaldeide tamponata al 4% (da paraformaldeide) e 50 μm tagli sono stati ottenuti dal cerebelio dal vibratoma. Le sezioni sono state trattate con il perossido di metanolo / idrogeno per rimuovere l’attività della perossidasi endogena, bloccata con una soluzione al 10% di capra normale e il 10% di siero del culo normale, con siero di un albumino del 1% di siero bovino, a 0, 1% di gelatina e 0, 01% di sodio azide in PBS, seguito da un trattamento 18 h di incubazione con antiserum anti-calbindiano conbbit (Sigma) (diluizione 1: 5000 preparato nello stesso tampone). I tagli sono stati quindi lavati per 4-8 ore in PBS e incubati per 18 ore in un anti-coniglio diluito immunoreattivi composti da un frammento di FAB2 coniugato a Perossidasi (alto nell’asino), assorbito assorbito a non reagire alle immunoglobine del mouse (Amersham) . Dopo 4 a 8 ore di lavaggio, i tagli sono stati sviluppati in una miscela di idrogeno a idrogeno standard, essiccato e lamellare.

Analisi statistiche

Analisi Kaplan – Meier Actuarial (figura 2) è stata eseguita Utilizzo del sistema statistico di assistere il sequestro e il recupero dei dati dei pazienti (Casper). Per i dati illustrati nelle figure 1 e 3, i valori medi vengono tracciati con gli errori standard della media. I valori P sono stati calcolati utilizzando un test T accoppiamento.

RICONOSCIMENTI

Questo lavoro è stato finanziato da borse di ricerca dal National Institute of Health (HD 28607 e HD 32654), da La fondazione delle malformazioni congenite marcia di Dimes (da 1 a 2224), una sovvenzione (RR 0071) del Centro nazionale di ricerca sul Monte Sinai. Centro di ricerca clinica generale e sovvenzione (93-00015) della Fondazione Scientifica Binational American-Israeliana. Vorremmo ringraziare il Dr. Lalji Singh, il centro della biologia cellulare e molecolare (India) per fornire la sonda specifica del cromosoma Y.

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