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terapia genica por células-tronco hematopoiéticas leva a uma melhoria clara de órgãos viscerais e a aparência tardia de anomalias neurológicas no modelo murino da doença de Niemann – escolha deficiente em esfingomielinase ácida

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abstrato

Niemann – pick (ndp) tipo Doenças do tipo A e B Resultados da atividade deficiente da esfingomielina (ASM). Atualmente, nenhum tratamento está disponível para uma ou outra forma de NDP. Usando o modelo do Mouse Knockout do ASM, avaliamos os efeitos da terapia genética de células-tronco hematopoiéticas ex vivo no fenótipo do NDP. Trinta e dois recém-nascidos de ratos ASMKO foram pré-concondicionados com radiação de baixa dose (200 CGy) e transplantadas com as células da medula óssea Asmko tendo sido transformadas com uma codificação de vetor retroviral ecotrópico para a ASM humana. O transplante de células derivado do doador variou de 15 a 60% com base na análise de hibridação in situ em glóbulos brancos periféricos e foi realizada em 92% dos animais enxertados. Níveis altos de atividade ASM (até cinco vezes maiores que o normal) foram encontrados em animais enxertados até 10 meses após o transplante e a duração da vida foram estendidos em uma média de 5 a 9 meses pelo procedimento de terapia gênica. As análises bioquímicas e histológicas de tecidos obtiveram 4 a 5 meses após o transplante mostraram um aumento nas atividades ASM e uma redução significativa no armazenamento de esfingomielina nos ratos tratados com baço, fígado e pulmões, principais sítios patológicos do tipo NDP B. O A presença de neurônios celulares de Purkinje também foi significativamente aumentada no grupo tratado em comparação com os animais não processados 5 meses após o transplante, e uma redução na memória dos neurônios da medula espinhal foi observada. No entanto, todos os ratos enxertados acabaram desenvolvendo uma ataxia e morreu mais cedo do que os ratos normais. No geral, esses resultados indicam que a terapia germinal hematopoiética deve ser eficaz para o tratamento do tipo B Ndp não neurológico, mas que melhoraram técnicas para direcionar as células do enxerto e / ou enzima expressa em locais patológicos específicos. O sistema nervoso central deve ser melhorado. Desenvolvido para obter tratamento eficaz tipo A NDP.

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introdução

niemann – escolha (npd) doença do tipo A e B são duas clinicamente distintas Formas de um distúrbio de armazenamento lisossomal causado pela deficiência hereditária em esfingomielina (ASM; CE 3.1.2.12). Atividade.123 Tipo A NDP é manifestado por um atraso de desenvolvimento, hepatosplenomegalia e uma rápida evolução neurodegenerativa progressiva geralmente levando à morte aos 3 anos. Por outro lado, o NDP do tipo B é caracterizado por hepatosplenomegalia, infiltrados pulmonares levando a infecções respiratórias freqüentes, envolvimento neurológico mínimo ou zero e adolescência ou sobrevivência adulta. A Spingomyelin e o colesterol se acumulam em pacientes com os dois fenótipos do NDP, mas os mecanismos fisiopatológicos específicos subjacentes à sua diferença clínica evolução permanecem desconhecidos.

Nos últimos anos, os genes ADNc e humanos e murinos foram isolados e expressos, 4567 mutações causando doenças foram identificadas8 e modelos murinos inativáveis foram produzidos910. As características clínicas, bioquímicas e patológicas do deficiente em ASM (ASMKO MICE) imitam o tipo A e B NDPs humanos, oferecendo assim a possibilidade de obter novas informações sobre a patogênese da doença e para desenvolver e avaliar novas abordagens terapêuticas.

Atualmente, nenhum processamento está disponível para uma ou outra forma de NDP. O transplante hepático em um homem com o tipo de NPD não foi bem sucedido 1112 e, embora os testes de transplante de transplante de transplante de transplante de medula óssea tenham sido relatados, 13141516, apenas um pequeno número de pacientes humanos foi estudado.

Contrariamente Estes estudos em humanos, uma análise completa da BMT foi realizada no mouse ASMKO1718. Esta técnica levou a uma melhoria na vida, melhorias histológicas e bioquímicas de vários órgãos clinicamente importantes, incluindo o fígado e o baço, e uma aparência do fenótipo neurológico.Assim, o uso de BMT alogênico para o tratamento do NDP do tipo B é fundada cientificamente, mas é complicado pela falta de doadores irmãos e irmã totalmente compatíveis na maioria das famílias NDP, a morbidade e a mortalidade associadas ao uso da irradiação total do corpo e reagentes imunossupressores., Assim como a doença do enxerto contra o host (GVHD).

O enxerto autólogo de células de medula óssea geneticamente modificadas (terapia genética por células-tronco hematopoiéticas, HSCGT) é, portanto, uma alternativa razoável ao TMO alogênico para o tratamento desta doença.19 Elimina os dois grandes problemas de disponibilidade de doadores e GVHD, teoricamente levando a uma diminuição na morbidade e mortalidade. Além disso, as células corrigidas obtidas por transferência de genes podem expressar / secretar a enzima em níveis maiores do que as encontradas em células normais, talvez levando à melhoria da eficiência clínica.

Experiências. Descrito neste manuscrito foi realizado Para avaliar se o transplante de baixa dose com células hematopoiéticas de transdução retroviral pode ser realizado a longo prazo, e se o transplante dessas células em camundongos recém-nascidos de ASMKO poderiam ter efeitos terapêuticos. Além disso, comparamos a eficácia desta abordagem terapêutica com os resultados anteriormente obtidos pelo transplante de células de medula óssea normal (ou seja, BMT).

transplante e enxerto

trinta e dois asmko Meios recém-nascidos (com idades entre 2 dias) têm sido transplantados com 1 × 10 6 células de medula ósseas tendo sido transformadas com um vector retroviral ASM / MFG EcoTrop (ver materiais e métodos para mais detalhes). A irradiação corporal total (200 CGY) tem sido usada para facilitar o transplante com as células doadores masculinos, para que os níveis de soquete de transplante possam ser avaliados em beneficiários por hibridização in situ usando uma sonda específica do cromossomo Y17. Cinco meses após o transplante, a WBC de doadores foi detectada em 92% das fêmeas transplantadas e a porcentagem dessas células (ou seja, enxerto) variou entre 15 e 60%, porcentagem de tomada de enxerto ligeiramente inferior àquela anteriormente obtida pela BMT17. Todos os animais enxertados foram determinados a ser positivos para a presença de sequências vetoriais em seus glóbulos brancos periféricos 3 e 8 meses após o enxerto usando um método de triagem de PCR (não apresentado).

Atividades ASM na WBC de Mouse ASMKO enxertado

As atividades do WBC ASM foram medidas mensalmente em animais individuais após o procedimento de transplante. Como mostrado na Figura 1, os ratinhos ASMKO tratados tiveram atividades significativamente maiores do que suas faixas normais (p < 0, 002). Os ratos ASMKO não tratados têm < 1% da atividade normal da ASM WBC.9 De 1 mês e até o quinto mês após o transplante, os níveis de atividade da atividade da WBC ASM em os animais aumentaram e se estabilizaram depois. No entanto, nenhuma correlação direta entre a atividade da ASM WBC e a sobrevivência (ver Figura 2 abaixo) foi observada ao analisar animais.

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ASM Atividades no WBC tratado asmko e os animais de controle. As amostras de sangue da órbita retiniana foram tomadas a cada mês após a transplante e os ensaios de atividade ASM foram realizados na WBC, conforme descrito em materiais e métodos. O gráfico mostra os valores médios e erros padrão dos ratos normais médios (▪), ASMKO (•) e asmko () transplantado. N = 32 para asmko enxertados e cinco para animais de controle normais e asmko submetidos à irradiação. Note que os animais de controlo ASMKO não tratados sobreviveram apenas até os 6 meses.

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Kaplan – Diagrama de Meier mostrando um aumento da sobrevida dos ratos ASMKO submetidos a HSCGT. Normal (▪), ASMKO (•) e ASMKO transplantado ().

Amostras de tamanho total

Amostras de soro de mouse injetadas foram analisadas por ELISA para a presença de anticorpos anti-hasm e imunoprecipitação para determinar se esses anticorpos inativaram a atividade enzimática. Todos os animais enxertados com sucesso tiveram níveis mensuráveis de anticorpos anti-hasm em seu plasma, mas em todos os casos esses anticorpos não inibiram a atividade imunoprecipitada à ASM (isto é, eles não eram neutralizadores, não representados).

Sobrevivência e crescimento de ratos ASMKO enxertados

Os efeitos do processo de terapia gênica na sobrevivência de ratinhos ASMKO são demonstrados na análise Kaplan-Meier mostrada na Figura 2. A vida de Os animais testemunhando a irradiação do tipo selvagem (ou seja, irradiada, mas não transplantada) foi normal (> 1 ano). ), enquanto todos os camundongos ASMKO submetidos ao controle da irradiação morreu entre 6 e 7 meses (idade média na morte 6, 4 meses). A maior longevidade foi observada em animais tratados com terapia genética. Por exemplo, aos 8 meses após o transplante, cerca de 75% dos animais tratados ASMKO sobreviveram, enquanto 10 meses após o transplante, esse número foi reduzido para 40%. No entanto, apesar de sua vida aumentada, a ataxia tornou-se evidente em camundongos transplantados por volta dos 6 meses e todos os animais tratados (com exceção daqueles que foram submetidos à morte prematuramente para fins experimentais) finalmente morreu aos 1 ano de idade . Antes dos 6 meses, os esquemas de tratamento do grupo de tratamento foram semelhantes aos do grupo de controle normal, mas depois perderam peso e seguiram uma evolução neurodegenerativa semelhante à de ratos ASMKO. Assim, o procedimento de terapia gênica atrasou a aparência dos sintomas neurológicos, mas não os impediu.

Actividade ASM e conteúdo de esfingomielina nos órgãos

cinco meses após o tratamento, um grupo de Seis animais enxertados (bem como três animais de controle normal e afetados) foram mortos e infundidos com solução salina para cobrar o sangue dos órgãos. Os fígados, os ratos, os pulmões, os rins, os corações e os cérebros foram então dissecados e congelados. Os níveis de atividade e spingomyeline foram avaliados nesses órgãos e os resultados são mostrados na Figura 3. Deve-se notar que os níveis de atividade ASM no baço, fígado e pulmões de animais ASMKO tratados foram cerca de 90, 65 e 40%. de normal, respectivamente, significativamente acima dos valores encontrados em animais ASMKO não tratados.9 (O valor de P durante a comparação das atividades ASM nestes tecidos entre os ratos ASMKO tratados e não tratados foi < 0, 0001.) Por outro lado, os níveis de atividade ASM encontrados no cérebro, os corações e os rins dos animais tratados não eram mais estatisticamente do que os encontrados em animais não tratados (valores de P > 0, 1).

ASM Atividades e conteúdo de spingomyseline em tecidos ASMKO e animais de controle tratados. (a) cinco meses após a transplante, as atividades ASM foram medidas em vários órgãos, conforme descrito em materiais e métodos. O histograma mostra uma comparação de atividades médias de ASM em animais tratados (n = 6) com as atividades detectadas nos mesmos tecidos normais e envelhecidos do mouse (n = 3). Linhas verticais indicam o erro padrão da média. (b) os níveis de esfingomielina foram medidos nos mesmos tecidos que os animais tratados e são representados pela porcentagem de redução em relação aos animais de controle ASMKO não tratados da mesma idade (n = 3).

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De maneira significativa, uma correlação significativa entre os níveis enzimáticos e a folga do substrato foi observada. De fato, em ratos e fígados, onde as atividades ASM foram significativamente altas, o acúmulo de esfingomielina foi reduzido a níveis quase normais (o valor de P quando a comparação do teor de espinhomia desses tecidos entre os ratos tratados e normais da ASMKO foi > 0, 1). Uma situação intermediária foi observada nos pulmões, enquanto no cérebro, corações e rins, praticamente não havia atividade detectável de ASM ou reduzindo a esfingomielina.

efeitos patológicos

figura 4 mostra Um representante de análise histológica de cortes de tecido de fígado, pulmões e ratos de indicadores de controle de mouse e irradiação tratados (ASMKO e normal) 5 meses após o transplante. Observe que cerca de 5 meses, os ratos ASMKO não tratados (F) tinham um importante armazenamento lipídico em comparação com animais normais (painéis A – C). Muitas células de formação de espuma pálida foram espalhadas nas seções do fígado e do baço e uma infiltração significativa de alvéolos e septos foram observadas nos pulmões, obstruindo o trato respiratório. Em particular, os tecidos dos animais tratados (painéis G – i) mostram um acúmulo de lipídios significativamente inferiores aos de animais de controle não tratados Asmko.Na Fig. 5, uma redução do material de armazenamento na medula espinhal dos animais tratados é mostrada por uma cor azul Azure II-metileno.

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Histologia não-SNC. Coloração com hematoxilina-eosina de fígado, pulmão e baço de controles normais representativos (A – C), controle ASMKO (D – F) e ratos ASMKO (G – I) tratados 5 meses após o transplante (ampliação inicial × 200).

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Histologia da medula espinhal. Asmko Mouse Cordas espinhal ASMKO (A) idades entre 5 meses e mouse asmko (b) transplantada. As setas indicam grânulos altamente basofílicos no citoplasma do motor do mouse ASMKO. Observe a redução deste material em animais transplantados.

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Para estudar os efeitos do HSCGT sobre a perda de células Pukinje (PC) que ocorre em ratos ASMKO , Comparamos seções cerebrais controladas e tratadas (transplante de 5 meses) imunorreagi com um anti-sério Calbindine, uma proteína de ligação de cálcio expressa exclusivamente no PC (Figura 6). ) Observe a perda do PC marcada em um controle ASMKO não tratado (Painel A) em relação a um representante da seção de um mouse tratado (painel b). De fato, um único lobo cerebelo mostra uma coloração de PC no animal ASMKO não tratado, enquanto os PCs estão presentes durante todo o cérebro ratos tratados e ratos normais de controle de irradiação. Esta figura também mostra que o procedimento de irradiação subtowal (200 CGY) usado para facilitar o transplante de células transplante não prejudicou o desenvolvimento e a distribuição de PCs no Animal Normal Cebel.

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imunohistoquímica de células de Purkinje. Corte sagital de Asmko (A) com 5 meses, transplantado ASMKO (B) e controle normal de irradiação (C) Cerebella. Observe que as células Purkinje estão presentes em uma extensão muito mais longa do cerebelo de mouse tratado com ratos não tratados.

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discussão

a finalidade deste O estudo foi determinar se o HSCGT poderia ser uma abordagem terapêutica eficaz para os NDPs do tipo A e / ou B. O modelo de mouse NPD (ASMKO) tem uma patologia do sistema nervoso central e visceral. Muito semelhante ao de pacientes com PNC humano, e é um excelente sistema para avaliar esta estratégia terapêutica e outros. Nos relatamos anteriormente os resultados da BMT em Camundongos ASMKO, 1718, e descobrimos que um regime de pré-condicionamento subletal em animais recém-nascidos pode resultar em transplante de alto nível sem aumentar a mortalidade ou artefatos patológicos. Além disso, demonstramos alteração significativa, mas incompleta de fenótipo em camundongos tratados. Em particular, o fenótipo histológico foi significativamente melhorado nos órgãos endoteliais reticulosos e a ocorrência de ataxia foi atrasada (ao mesmo tempo como uma maior retenção de neurônios de PC), mas todos os animais tratados finalmente desenvolveram sintomas neurológicos. E morreu prematuramente .

O HSCGT tem várias vantagens potenciais sobre a BMT em pacientes com o PNC humano, incluindo o fato de que as células transplantadas não precisam necessariamente ser derivadas de doadores normais ou heterozygous compatíveis com HLA.. Além disso, as células autólogas transduzidas podem potencialmente superexpressar a transgene, talvez levando a uma resposta terapêutica aumentada. Neste estudo, as atividades do ASM WBC maiores que o normal foram obtidas de vários animais tratados durante o período de endosso de 10 meses. e descobertas bioquímicas em órgãos viscerais e neurodegeneração atrasada, todos os ratos transplantados finalmente desenvolveram uma ataxia e morreram prematuramente.

Deve-se notar que as taxas do enxerto obtidas pelo protocolo de terapia gênica. Como determinado pela hibridização in situ Com uma sonda específica do cromossomo Y, foram menores do que as obtidas pela BMT17, apesar do fato de que o procedimento de transplante (por exemplo, número de células, irradiação) era o mesmo. Esses resultados destacam várias diferenças importantes entre as duas abordagens terapêuticas.Por exemplo, durante o transplante normal da medula óssea, nenhum manejo de células foi realizado, ou seja, o conteúdo total das células da medula óssea retirados de ossos do doadores normais foi transplantado sem cultivo celular ou divisão. No protocolo de terapia gênica, uma população de células mononucleares, isoladas por centrifugação descontínua com gradiente de densidade, foi mantida em cultivo por 2 dias na presença de fatores de crescimento e transduzida com o vetor retroviral. Isso pode explicar os níveis mais baixos de enxerto observados.2021

No entanto, apesar de um transplante inferior, níveis mais altos de atividade enzimática geralmente foram detectados no GBS e órgãos de órgãos tratados com terapia. Gênio comparado àqueles que recebem Tmo. Esses dados são consistentes com os de outros pesquisadores que mostraram uma expressão de longo prazo e alta de transgêneros em ratos ou ratos enxertados com células hematopoiéticas transduzidas pela MFG.222324 de acordo com a alta expressão enzimática, uma correção quase completa. De reticulação Sistema endotelial A patologia do sistema, que só foi observada quando o transplante de transplante transplante permitiu obter um transplante de alto nível (isto é, > 90%) 18, em animais Tratado com terapia gênica enxertada em 30% ou menos.

A perda de neurônios do PC no Cerebel do Mouse de NPD pode ser uma das principais características de sua patologia do SNC91825. É também a provavelmente causa de ataxia progressiva, que finalmente leva à morte. Foi relatado que os ceramides foram um fator crítico na sobrevivência dos neurônios do PC Cerebelan.26 A inibição da síntese de ceramida causou uma diminuição na sobrevivência celular, acompanhada por uma indução de morte celular apoptótica e uma diferenciação dendrítica aberrante de PCs, sem modificação detectável de outras lesões cerebelares. Neurones.26 Por outro lado, durante a exposição à esfingomielina bacteriana, a filial de sobrevivência e dendrítica do PC aumentou, provavelmente devido ao aumento da produção de ceramidas. A fim de monitorar a perda dos neurônios do PC no cérebro dos animais tratados com ASMKO, realizamos uma imuno-histoquímica usando um anti-soro com calbindina. Calbindine D28K pertence à grande família de mão EF, deveria trabalhar, parcialmente, como um buffer cálcico citosólico. Codifica uma proteína de ligação de cálcio expressa no cerebelo exclusivamente no PC.272829. Mês após o transplante, houve um aumento no número de PCs em camundongos tratados com ratos de controle irradiados afetados. Estes resultados provavelmente devido à presença na SNC de células microgly derivadas da medula óssea e transduzidas por meios retrovirais capazes de segregar as MSA em quantidades suficientes para retardar a morte celular específica da doença nos neurônios do PC. Resultados semelhantes foram observados em nossos estudos sobre BMT.18 Também é interessante notar que esses resultados foram obtidos apesar do fato de que nenhum aumento detectável na atividade ASM não pôde ser visto em homogenatos cerebrais. Animais tratados. Este resultado é consistente com o fato de que muito poucas células derivadas do doador conseguiram atravessar a barreira do cérebro sanguíneo após a irradiação sublética e um transplante 17, e indicar que níveis muito baixos de MSA são suficientes para atrasar a morte do CP. , sem avisá-los.

Então, como o BMT alogênico, o HSCGT aparece como uma opção terapêutica viável para o tipo de NPD B. É particularmente notável que os efeitos histológicos / clínicos equivalentes foram obtidos nos tempos por Os procedimentos da BMT e do HSCGT, apesar do fato de que os níveis mais baixos do enxerto foram obtidos por eles. Este resultado, associado ao fato de que a necessidade de embalagens imunossupressoras é consideravelmente reduzida durante o transplante de células autólogas em relação às células alogênicas, reforça a ideia de que o HSCGT pode constituir tratamento adequado para os pacientes com DPC do tipo B é humano. No entanto, deve-se notar que, apesar desses resultados encorajadores no modelo murino, obtendo os mesmos resultados em pacientes humanos é agora problemático porque os vetores de transferência de genes atualmente disponíveis não são capazes de traduzir efetivamente as células-tronco hematopoiéticas eficientemente humanas. Assim, a BMT alogênica continua sendo a única opção terapêutica disponível para indivíduos com NPD Type B.No que diz respeito ao tipo A NDP, os dados indicam que baixos níveis de expressão do ASM no CNS podem levar a melhorias neurológicas parciais, mas é improvável que, como a BMT, impeça a rápida e neurodegenerativa evolução desta doença. Assim, novas abordagens devem ser desenvolvidas para melhorar a distribuição de células transplantadas no SNC e / ou aumentar a expressão do ASM derivada do vetor no cérebro do tipo NPD para tratamento eficaz. P.>

Retroviral Construção de vetor e preparação de células produtoras de xoxico

O vetor retroviral ASM / MFG foi construído inserindo o ADNc de ASM Humano Completo (HASM) no Vetor MFG como descrito anteriormente .30 em suma, PCR A mutagênese foi usada para introduzir um local de restrição NCOL no códon de iniciação da tradução do tipo Nature Hasm para otimizar a tradução e facilitar a clonagem. Para gerar linhas de células de pacote retroviral anfotrópico, o vetor ASM / MFG foi co-eletroporado com plasmídeo psv2neo em células de embalagens anfotropáticas Envio1231 e submetido a uma seleção por G418. Os ambientes foram coletados de clones individuais de células produtoras virais, e o clone do produtor que leva à atividade mais alta ASM após a transdução de células NIH-3T3 tem sido usada para experimentos subseqüentes. O título do clone do produtor foi estimado medindo o aumento da atividade ASM obtida após a transdução de células NIH-3T3 com diluições seriais do meio das células produtoras, bem como pelo Southern Blot. Métodos semelhantes para estimar títulos com base na atividade enzimática foram publicados para vários outros vetores MFG na ausência de um sistema de marcador selecionável.3233

Preparação de células produtoras ecotrópicas

para preparar eco – As células emproduto, a linha de células produtoras de xotrópico com o maior título foi cultivada a uma confluência de cerca de 80% no ambiente de águia modificado de Dulbecco (DMEM, Gibcobrl, Gaithersburg, MD, Estados Unidos) contendo 20% de bezerro fetal soro e antibióticos. Após 24 h, o meio foi colhido, concentrado usando 300 K Pall Pall Filtron Corporation, East Hills, NY, Estados Unidos), combinado com antibióticos contendo médio fresco e polibubere. 8 μg / ml (Sigma, St Louis, Mo, Estados Unidos) . O processo foi repetido três vezes ao longo de um período de 3 dias, então as células produzidas ecológicas transduzidas foram colhidas e diluídas em uma concentração final de 100 células por dia. 10 ml para replicação e clonagem subseqüentes. O DNA foi preparado a partir de clones de células ecotrópicos individuais e submetido a PCR quantitativa (veja abaixo), e o clone com o maior número de cópias provisórias foi mantido e usado para transdução de células.

Preparação de células doadores

A colônia do mouse ASMKO foi estabelecida a partir de pares reprodutivos heterozigóticos obtidos por segmentação genética de células-tronco embrionárias 129 / SV e por microinjecção em camundongos C57BL / 6.9 Blastocists ASMKO (de 8 a 12 semanas) foram utilizados como uma fonte de células doadoras. Para obter células de medula ósseas nucleadas, os doadores foram pré-tratados com 5FU (150 mg / kg) 48 h antes da morte por deslocamento cervical. As células da medula óssea foram colhidas das tibias e fêmures ao enxaguar as cavidades da coluna vertebral com uma solução tamponada de hank (10 μmol / ml hepes, pH 7, 5) e uma agulha de 27 calibre. As suspensões monocelulares foram obtidas por células passageiras através de 40 μm de peneira de células de nylon (Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, EUA). Células de medula óssea de baixa densidade (< 1, 085 g / cm 3) foram isolados por centrifugação de gradiente de densidade descontínua usando Nycoprep (Nycomed Pharma como, Oslo, Noruega) 35 e lavado com uma solução de hanks armazenados contendo 5% de soro de vitelo fetal inactivado a 5%. As células foram então contadas, diluídas com a concentração desejada e transducada retroviralmente conforme descrito abaixo.

Transdução retroviral de células de medula óssea

Os sobrenadantes de vírus ecológicos foram concentrados usando tubos de filtro de 300k macrosep de acordo com as instruções do fabricante.Para alcançar a transdução retroviral, cerca de 1 x células de medula óssea io9 de doadores de asmko masculinos foram cultivados por 48 horas em 10 ml de dmem contendo o vetor de ecotrope concentrado / MFG Ecotope retroviral, 20% soro de bezerro fetal inativado pelo calor e antibióticos. As culturas também continham CSF (50 ng / ml), IL-3 (20 ng / ml), IL-6 (10 ng / ml) (Genzyme, Cambridge, MA, EUA) e 8 μg / ml de polybrene.36373839. Durante as primeiras 24 horas, o ambiente foi substituído por um pequeno meio contendo o vírus recém-colhido e concentrado, fatores de crescimento frescos e o polybrew.

Análise de PCR para detectar o vetor ASM / MFG

Uma alteração em nosso procedimento descrito anteriormente foi utilizado.30 MWG endógeno e sequências humanas endógenas endógenas foram amplificadas utilizando um primário do senso comum, Exon 3 ‘TGCTGaggatcgagaga CAA -3′ (P1), construído de ASM Human e Murin Exon 3 e dois primers anti-sentido específicos de espécies, 5’-gggtaggtgacagaagattga-3 ‘(P2) e 5′-GgcacaagagAgcaGCAG-3’ (P3), construídos a partir do mouse e intrão humana ASM ASM, respectivamente. Os pares de primer P1 e P2 amplificaram um produto genômico genômico murino específico de 211 pb, enquanto os pares de primer PL e P3 amplificaram um produto 554 BP do vetor MFG específico do homem. Cada reação de amplificação (cerca de 100 μl de volume final) continha 200 pmol de primer P1, 100 pmol primers P2 e P3, 300 Ng DNA genómico, 1x tampão de PCR, 1, 5 mm de MgCl 2, 5u Taq polimerase (Promega, Madison, Wi, EUA) e 200 mm cada um dos DNTP. Uma curva padrão foi gerada usando misturas de DNA conforme descrito acima.20 após a amplificação (30 ciclos, cada um composto por 1 minuto a 93 ° C, 61 ° C e 72 ° C), os produtos de PCR foram separados por eletroforese em uma solução de agarose a 1, 5%. Géis e colorido com brometo de etídio. A intensidade das fitas foi determinada usando o pacote de software do Nih Imager.

Transplante de transplante de transplante

Trinta e dois mouse mais antigo de Asmko de 2 dias foram usados como receptores. Antes de receber o transplante, os destinatários foram submetidos a uma dose única de irradiação total do corpo de 200 cgs de uma dupla fonte de 137 CS (taxa de dose, 80 CGY / min). Cada animal recebeu um total de 1 × 10 6 células / g peso corporal injetado por via intravenosa. Companheiros de lixo da mesma idade (normal e asmko, n = 5 para cada) foram usados como indicadores de irradiação (ou seja, irradiados, mas não transplantados). Os animais foram mantidos de acordo com um ciclo leve / escuro de 12 horas, água à vontade e purina para roedores purina 5001. Nenhum antibiótico ou outro tratamento de apoio foi administrado a qualquer um dos animais antes ou depois do transplante.

Avaliação pós-enxerto

Os pesos de animais transplantados e cookies foram registrados mensalmente. O sangue periférico também foi obtido por sangramento de órbita retiniana para uma análise mensal das enzimas em glóbulos brancos (WBC) (veja abaixo).

Hibridização in situ do cromossomo Y

As amostras de sangue foram tomadas 5 meses após o transplante para estimar o transplante nos receptores. WBCs foram isolados usando um tampão hemolítico (NH 4 0, 1 m, NaHCO312 M, EDTA 10 m M, pH 8, 0), fixado em uma solução carnoy (ácido metanol-acético 3: 1) e colocado em lâminas de microscópios . As células foram tratadas com HCl 0, 1 m contendo 0, 05% Triton X-100 por 7, 5 minutos a 37 ° C, fixados em paraformaldeído tamponado de 1% (pH 7, 4) durante 15 minutos a 24 ° C, desidratado em etanol. Hibridações foram realizadas incubando as lâminas durante a noite em uma sala umidificada a 37 ° C com uma solução (2x SSC, 50% de formamida, 10% dextrano sulfato, 0, 1% Tween 20, 0, 5 mg / ml de DNA de salmão ) contendo 4 ng / μl de uma sonda de sensor específica do mouse biotinilada [M34) (M34) .40 Após a hibridização, as lâminas foram lavadas e desenvolvidas usando uma avidina conjugada de fluoresceína (5 μg / ml) (Sigma, St Louis, Mo, EUA ), seguido por amplificação com biotinilado anti-avidina (2 μg / ml) (laboratórios vetoriais, Burlingame, CA, EUA). Em seguida, foi realizada uma segunda incubação / amplificação com o conjugado de fluorescein-avidina para maximizar a sensibilidade à detecção. As células foram então contra-cor com iodeto de propídio (100 μg / ml) (Sigma) e montado num meio anti-Grove (tris-HCl 10 mm pH 7, 5 contendo 20 mg / ml de Dabco (trietilenodiamina- 1, 4-diazabiciclo octano; sigma) em glicerol). 300 núcleos foram marcados para determinar a porcentagem de células derivadas do doador no sangue enxertado.

teste imunoassorbente enzimático (ELISA) e imunoprecipitação

Para detectar a presença de anticorpos dirigidos contra os HPs recombinantes expressos, os dosagens ELISA foram realizadas no plasma de camundongos tratados e não tratados. O HASM purificado foi incubado durante 18 horas em placas de microtitulação de 96 poços. Os poços foram lavados 3 vezes com o tampão de lavagem 1 (WB1, tris 10 mm, pH 7, 5, NaCl 150 mm, Tween 20 0, 05%), depois bloqueado por 1 hora com BSA a 3% em PBS à temperatura ambiente . Dilues plasmáticos tratados e não tratados em WB1 (100 μl a uma diluição de 10 -2, 10 -3, 10 -4) foram adicionados aos poços e incubados a 37 ° C durante 3 h. Os poços foram lavados 3 vezes com WB1, em seguida, 100 μl de cabra conjugada por peroxidase (Sigma) (Sigma) (1: 500 diluição em WB1) e uma incubação de 2 horas à temperatura ambiente foram adicionados à temperatura ambiente. Os poços foram novamente lavados 3 vezes com WB1 e 2 vezes com o tampão de lavagem 2 (10 mm pH 7, 5, NaCl 150 mm). Um substrato de peroxidase foi então adicionado aos poços (100 pés) e incubados à temperatura ambiente durante 30 minutos. Um leitor de placa ELISA automatizado foi utilizado para determinar a absorvância a 405 nm.

Os testes de imunoprecipitação foram utilizados para determinar se os anticorpos presentes nos camundongos tratados inactivaram a enzima expressa. Uma solução de 500 u de HASM, 1 ml de PBS, 10 μl de plasma de mouse (tratado ou indicador) e 1 mg / mL de BSA foi incubado durante 18 h a 4 ° C em uma roda rotativa. Em seguida, foram adicionados 100 μl de proteína G-Sepharose diluído a 1: 1 em PBS foram adicionados à solução e incubados durante 4 horas a 4 ° C. Após centrifugação a 14 000 rpm durante 2 min, a atividade de ASM em sobrenadantes e pelotas foram analisados.

ASM ensaio de atividade

A linha esfingomio covalented com a sonda fluorescente do BODIPY (BODIPY Dodecanoyle Spingosil fosfocolina, BOP12-SPM) é sintetizada como anteriormente descrita para a liSmina Rhodamine Spingomyelin (LR12- SPM) 41, com exceção do ácido bodipy dodecanoico (sondas moleculares, Eugene, Ouro, EUA) condensado com fosfocolina esfingosil. A clivagem do Dbo12-SPM pelo ASM libera a ceramida fluorescente, que pode ser quantificada após a separação por CCM ou extração orgânica. WBCs ou tecidos foram obtidos como previamente descrito18 e homogeneizado no Triton X-100 a 0, 2% no gelo usando três 10 segundos de um homogeneizador de tecido Potter-Elvehjem (Thomas Scientific, Sweedesboro, NJ, EUA). A proteína total foi determinada pelo método de Stein et al.42. A mistura de ensaio padrão com 15 μl de ASM consistia de 10 μl de amostra (células homogeneizadas ou tecidos) e 2 NMOL de Dbo12-SPM suspenso em tampão de acetato de sódio 0, 1 m, pH 5, 2., contendo 0, 6% triton x -100 e 5 mm EDTA (para detectar a atividade de ASM não-zinco-dependente) ou ZNCL 2 0,1 mm (para detecção da atividade L ASM estimulada pelo zinco) .43 Após a incubação da mistura de teste a 37 ° C Para 3 h), as amostras foram carregadas em placas de cromatografia de camada fina (TK Silica Gel LK6 D 60, Whatman, Clifton, Nova Jersey, Estados Unidos) e resolvidos usando uma mistura de clorofórmio / metanol (95: 5 v / v). Após a resolução, a fita contendo a ceramida marcada com fluorescência foi raspada das placas CCM, extraída numa mistura de clorofórmio / metanol / água (1: 2: 1 v / v) por 15 min a 55 ° C e quantificada num espectrofluorômetro. 204 – um espectrofotômetro de fluorescência, perkin elmer). O instrumento foi definido para comprimentos de onda de excitação e emissão de 505 e 530 nm, respectivamente.

Spingomyeline Analysis

Taxas de spexyeline (SPM) foram determinadas a partir do teor de fosfato de cada amostra.44 Tecidos (cérebro, fígado, pulmão e baço) foram homogeneizados em uma mistura de clorofórmio / metanol (1: 2 v / v) para vista. Extração lipídica. Uma hidrólise fosfolipídica alcalina foi realizada em amostras de fígado, pulmão e baço em Koh 0, 4 n / metanol a 90% para 2 h a 55 ° C. Para prevenir a interferência de plasmólico e outros fosfolipídios nos extratos cerebrais, foi realizada uma hidrólise ácida Nestas amostras usando HCl 0, 6 m em etanol por 30 min a 37 ° C antes da hidrólise alcalina. Após a hidrólise, as amostras foram incubadas com ácido perclórico (70%) por 40 minutos a 180 ° C, depois tratados com molibdato de amónio a 0, 5% e um redutor de fiske e sub -na (4 mg / ml; sigma) por 10 min em 100 ° C. A absorvância a 830 nm foi medida em um espectrofotômetro (modelo 1201, Milton Roy Spectronic, Rochester, NY, EUA).

Preparação de tecidos para histologia

Os ratinhos foram anestesiados com cetamina (Sigma; 0, 5 g / kg de peso corporal) e sujeito a infusão cardíaca. Uma incisão foi feita no átrio direito para permitir que o sangue flua, e uma cânula foi introduzida na aorta através do ventrículo esquerdo, entregando 50 ml de uma solução quente a 0, 9% naCl. As amostras de tecido para microscopia óptica foram fixadas em formalol tamponadas de 10%, incluídas na parafina, cortadas em cortes e coloridas em hematoxilina e eosina. As amostras SNC foram tomadas após a infusão de glutaraldeído, postfixed em tetróxido de osmose, incrustados em um epónio, cortados em corte e colorido com metileno azul II.

Purkinje a imunodetecção de células.

os tecidos eram Corrigido por infusão vascular com 4% de formaldeído tamponado (do paraformaldeído) e cortes de 50 μm foram obtidos a partir da cerepla por vibratoma. As seções foram tratadas com peróxido de metanol / hidrogênio para remover a atividade de peroxidase endógena, bloqueada com uma solução para 10% de cabra normal e 10% de soro normal de bunda, com 1% sérico de albumina soro bovino, a 0, 1% gelatina e 0, 01% Azida de sódio em PBS, seguida de um tratamento 18 h de incubação com anti-calbindina anti-resmuno (Sigma) (diluição 1: 5000 preparada no mesmo tampão). Os cortes foram então lavados por 4 a 8 horas em PBS e incubados por 18 horas em uma imunorreactiva anti-coelho diluída composta por um fragmento fab2 conjugado à peroxidase (alta no burro), absorvido absorvido para não reagir às imunoglobinas de mouse (Amersham) . Após 4 a 8 horas de lavagem, os cortes foram desenvolvidos em uma mistura padrão de hidrogênio, seca e lamelada.

Análises estatísticas

Análise Kaplan – Meier Atuarial (Figura 2) foi realizada Usando o sistema estatístico de assistência à convulsão e recuperação de dados do paciente (Casper). Para os dados ilustrados nas Figuras 1 e 3, os valores médios são plotados com os erros padrão da média. Os valores de P foram calculados usando um teste T emparelhado.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado por subvenções de pesquisa do Instituto Nacional de Saúde (HD 28607 e HD 32654), A fundação de malformações congênitas March of Dimes (1 a 2224), uma subvenção (RR 0071) do Centro Nacional de Pesquisa no Monte Sinai. Centro Geral de Pesquisa Clínica e uma concessão (93-00015) da Fundação Científica Binacional Americana-Israel. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Lalji Singh, o centro de célula e biologia molecular (Índia) para fornecer a sonda específica do cromossomo Y.

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