Skip to content

terapie genică de către celulele stem hematopoietice duce la o îmbunătățire clară a organelor viscerale și la apariția târzie a anomaliei neurologice în modelul murin al bolii Niemann – alegerea deficitară în sphingomielinază acidă

Posted in Articles

Abstract

Niemann – Pick (NDP) Boli de tip A și B rezultă din activitatea deficitară a sfingomyelinazei acide (ASM). În prezent, niciun tratament nu este disponibil pentru una sau altă formă de PND. Folosind modelul Mouse Knockout ASM, am evaluat efectele terapiei genice de celule stem ematopoietice ex vivo pe fenotipul NDP. Treizeci și doi șoareci de ASMKO nou-născuți au fost precondiționați cu radiații scăzute de doză (200 cgy) și transplantate cu celulele măduvei osoase ASMKO fiind transducate cu un vector retroviral ecotropic care codifică ASM uman. Transplantul de celule derivate donator a variat de la 15 la 60% pe baza analizei de hibridizare in situ privind celulele albe din sânge periferice și a fost efectuată la 92% din animalele grefate. Nivelurile ridicate de activitate ASM (până la cinci ori mai mare decât normal) au fost găsite la animalele grefate până la 10 luni după transplantarea și durata vieții au fost prelungite cu o medie de 5 până la 9 luni de procedura de terapie genică. Analizele biochimice și histologice ale țesăturilor obținute la 4 până la 5 luni după ce transplantul au înregistrat o creștere a activităților ASM și o reducere semnificativă a depozitării sfingomielinului în șoarecii tratați cu splină, ficat și plămâni, principalele situri patologice ale NDP de tip B. Prezența neuronilor celulelor Purkinje a fost, de asemenea, mărită în mod semnificativ în grupul tratat comparativ cu animalele care nu au fost procesate la 5 luni după transplantare și a fost observată o reducere a memoriei neuronilor măduvei spinării. Cu toate acestea, toți șoarecii grefați au ajuns să dezvolte o ataxie și au murit mai devreme decât soarecii normali. În ansamblu, aceste rezultate indică faptul că terapia germinală hematopoietică ar trebui să fie eficientă pentru tratamentul nDP neurologice tip B, dar acele tehnici îmbunătățite pentru direcționarea celulelor grefei și / sau enzime exprimate pe situri patologice specifice. Sistemul nervos central trebuie îmbunătățit. Dezvoltat pentru a obține un tratament eficient de tip AND Forme ale unei tulburări de depozitare lizozomale cauzate de deficiența ereditară în sphingomielinază acidă (ASM; EC 3.1.2.12). Activitate.123 Tipul A PND se manifestă printr-o întârziere de dezvoltare, hepatosplenomegalia și o evoluție neurodegenerativă progresivă, conducând în general la moarte la 3 ani. Pe de altă parte, PND de tip B este caracterizat de infiltratele pulmonare Hepatosplegalomegal, ducând la infecții frecvente respiratorii, o implicare neurologică minimă sau zero și de supraviețuire adolescentă sau adultă. Spingomielin și colesterol se acumulează la pacienții cu cele două fenotipuri PND, dar mecanismele fiziopatologice specifice care stau la baza evoluției clinice distincte rămân necunoscute.

În ultimii ani, ADNc și genele ASM umane și murine au fost izolate și exprimate, 4567 mutațiile care cauzează afecțiuni de boli8 și au fost produse modele murine inactivabile910. Caracteristicile clinice, biochimice și patologice ale deficitului de la ASM (șoareci ASMKO) impermea NDP de tip A și B, oferind astfel posibilitatea de a obține noi informații despre patogeneza bolii și de a dezvolta și evalua noi abordări terapeutice.

În prezent, nu este disponibilă nicio prelucrare pentru una sau altă formă de PND. Transplantul hepatatic la un bărbat cu NPD de tip A a fost nereușit 1112 și, deși au fost raportate testele de transplant de transplant de transplant de transplant de transplant de transplant osos amniotic osos, 13141516, doar un număr mic de pacienți umani a fost studiat.

contrar. Aceste studii la om, o analiză completă a BMT a fost efectuată în ASMKO1718 de șoarece. Această tehnică a condus la o îmbunătățire a vieții, îmbunătățirile histologice și biochimice ale mai multor organe importante din punct de vedere clinic, inclusiv ficatul și splina și apariția fenotipului neurologic.Astfel, utilizarea BMT alogeneică pentru tratamentul PND de tip B este fondată științific, dar este complicată de lipsa donatorilor frate și sora complet compatibili în majoritatea familiilor PND, morbiditatea și mortalitatea asociată cu utilizarea iradierii totale a corpului și Reactivi imunosupresivi., precum și boala grefei împotriva gazdei (GVHD).

grefa autologă a celulelor măduvei osoase modificate genetic (terapie genică prin celule stem hematopoietice, HSCGT) este, prin urmare, o alternativă rezonabilă la TMO alogeneică pentru tratamentul acestei boli.19 Elimină cele două probleme majore ale donatorului și disponibilității GVHD, conducând teoretic la o scădere a morbidității și a mortalității. În plus, celulele corectate obținute enzimatic prin transferul genei pot exprima / secreta enzima la niveluri mai mari decât cele găsite în celulele normale, ceea ce duce la îmbunătățirea eficienței clinice.

Experimente. Descrisă în acest manuscris au fost întreprinse în acest manuscris Pentru a evalua dacă transplantul cu doză mică cu transducție retrovirală celulele hematopoietice ar putea fi efectuate pe termen lung și, în cazul în care transplantul acestor celule la șoarecii nou-născuți ASMKO ar putea avea efecte terapeutice. În plus, am comparat eficacitatea acestei abordări terapeutice cu rezultatele obținute anterior de transplantul celulelor măduvei normale (adică BMT).

Transplantul și grefa

treizeci și doi ASMKO Șoarecii nou-născuți (în vârstă de 2 zile) au fost transplantați cu 1 × 106 celule măduvei osoase care au fost transducate cu o vector retrovirală ASM / MFG ecotrop (vezi materialele și metodele pentru mai multe detalii). Sucbletale de iradiere totală a corpului (200 cgy) a fost utilizată pentru a facilita transplantul cu celule donatoare de sex masculin, astfel încât nivelurile socket de transplant pot fi evaluate în recipiente prin hibridizare in situ utilizând o sondă specifică a cromozomului Y17. La cinci luni după transplant, WBC de la donatori au fost detectate la 92% dintre femeile transplantate și procentul acestor celule (adică grefă) a variat între 15 și 60%, procent din priza de grefă ușor inferioară la cea obținută anterior de BMT17. Toate animalele grefate au fost determinate ca fiind pozitive pentru prezența secvențelor vectoriale în celulele albe din sângele periferice 3 și 8 luni după greful utilizând o metodă de screening PCR (nu este prezentată).

Activități ASM în WBC de ASMKO Mouse Grefted

Activitățile AȘM WBC au fost măsurate lunar la animalele individuale după procedura de transplant. După cum se arată în figura 1, șoarecii ASMKO tratați aveau activități de ASM semnificativ mai mari decât intervalele normale (p < 0, 002). Șoarecii ASMKO netratați au < 1% din activitatea normală de ASM WBC.9 de la 1 lună și până în a cincea lună după transplant, nivelurile de activitate ale activității ASM WBC în tratate animalele au crescut treptat și stabilizate ulterior. Cu toate acestea, nu s-a observat o corelație directă între activitatea WBC AȘM și supraviețuirea (a se vedea figura 2 de mai jos) atunci când analizează animalele.

ImageImagine

ASM ACTIVITĂȚI ÎN ASM ASMKO tratate cu ASMKO și controlul. Probele de sânge ale orbitelor retinale au fost luate în fiecare lună după ce testele de activitate de transplant și AȘM au fost efectuate pe WBC, așa cum este descris în materiale și metode. Graficul prezintă valorile medii și erorile standard ale șoarecilor normali mediu (▪), ASMKO (•) și ASMKO () transplantați. N = 32 pentru ASMKO grefate și cinci pentru animalele normale de control și ASMKO supuse iradierii. Rețineți că animalele de control ASMKO netratate au supraviețuit numai până la vârsta de 6 luni.

Imagine de dimensiune completă

Imagine

Kaplan – Diagrama Meier care prezintă o supraviețuire sporită a șoarecilor ASMKO trimisă către HSCGT. Normal (▪), ASMKO (•) și ASMKO transplantat () Determinați dacă acești anticorpi inactivați activitatea enzimatică. Toate animalele grefate cu succes au avut niveluri măsurabile de anticorpi anti-hasm în plasmă, dar, în toate cazurile, acești anticorpi nu au inhibat activitatea ASM imunoprecipitată (adică nu au fost neutralizați, nu au fost reprezentați).

Supraviețuirea și creșterea șoarecilor ASMKO grefted

Efectele procedurii de terapie genică asupra supraviețuirii șoarecilor ASMKO sunt demonstrate în analiza Kaplan-Meier prezentată în figura 2. Viața lui Animalele care mărturisesc iradierea de tip sălbatic (adică iradiată, dar nu transplantată) a fost normală (> 1 an). ), în timp ce toți șoarecii ASMKO supuși controlului iradierii au decedat între 6 și 7 luni (vârsta medie la moarte 6, 4 luni). S-a observat o longevitate crescută la animalele tratate cu terapie genică. De exemplu, la 8 luni de la transplant, aproximativ 75% din animalele tratate ASMKO au supraviețuit, în timp ce 10 luni de la transplant, acest număr a fost redus la 40%. Cu toate acestea, în ciuda creșterii vieții lor, ataxia a devenit evidentă la șoarecii transplantați în jurul vârstei de 6 luni și toate animalele tratate (cu excepția celor care au fost puse la moarte prematur în scopuri experimentale) au decedat în cele din urmă la vârsta de 1 an . Înainte de vârsta de 6 luni, schemele de tratament ale grupului de tratament au fost similare cu cele ale grupului normal de control, dar au pierdut apoi greutatea și au urmat o evoluție neurodegenerativă similară cu cea a șoarecilor ASMKO. Astfel, procedura de terapie genetică a întârziat apariția simptomelor neurologice, dar nu le-a oprit. Activitatea ASM și conținutul de sphingomieină în organele

cinci luni după tratament, un grup de Șase animale grefate (precum și trei animale de control normale și afectate) au fost puse la moarte și infuzate cu soluție salină pentru a percepe sângele din organe. Ficatul, șobolanii, plămânii, rinichii, inimile și creierul au fost apoi disecate și înghețate. Nivelurile de activitate ASM și conținutul de sphingomielină au fost evaluate în aceste organe și rezultatele sunt prezentate în figura 3. Trebuie remarcat faptul că nivelurile de activitate ASM din splină, ficat și plămâni ai ASMKO animale tratate au fost de aproximativ 90, 65 și 40%. de normal, respectiv, în mod semnificativ deasupra valorilor găsite în animalele ASMKO care nu sunt tratate.9 (valoarea P în timpul comparației activităților AȘM în aceste țesuturi între șoarecii ASMKO tratați și netratați a fost < 0, 0001.) Pe de altă parte, nivelurile de activitate ASM găsite în creier, inimile și rinichii animalelor tratate nu au fost mai statistic decât cele găsite la animale netratate (valori ale P > 0, 1).

Imagine

ACTIVE ASM și conținut de sphingomieline în țesuturile ASMKO și animalele de control tratate. (a) la cinci luni după transplant, activitățile ASM au fost măsurate în mai multe organe, așa cum este descris în materiale și metode. Histograma prezintă o comparație a activităților medii de ASM la animalele tratate (N = 6) cu activitățile detectate în același țesut de șoarece de control normal și în vârstă (n = 3). Liniile verticale indică eroarea standard a mediei. (b) nivelurile de sfingomielin au fost măsurate în aceleași țesuturi ca și animalele tratate și sunt reprezentate de procentul de reducere comparativ cu animalele de control ASMKO care nu sunt tratate de aceeași vârstă (n = 3).

Imaginea de dimensiune completă

În mod semnificativ, a fost observată o corelație semnificativă între nivelurile enzimatice și clearance-ul substratului. Într-adevăr, la șobolani și la ficaturi, unde activitățile ASM au fost semnificativ ridicate, acumularea de sfingomielin a fost redusă la niveluri aproape normale (valoarea P Când comparația conținutului de sphingomieline a acestor țesuturi între șoarecii ASMKO și șoarecii normali a fost > 0, 1). O situație intermediară a fost observată în plămâni, în timp ce în creier, inimi și rinichi, nu a fost practic nici o activitate detectabilă a ASM sau reducerea sfingomielinului.

efecte patologice

Figura 4 arată O analiză histologică reprezentativă a tăieturilor de țesături de ficat, plămâni și șobolani de indicatori de control al mouse-ului și iradiere (ASMKO și Normal) la 5 luni după transplant. Rețineți că, la vârsta de 5 luni, șoarecii ASMKO netratați (F) au avut o depozitare lipidică importantă în comparație cu animalele normale (panourile A – C). Mulți celule de spumare palide au fost împrăștiate în secțiunile hepatice și splinei și a fost observată o infiltrare semnificativă de alveole și septa în plămâni, obstrucționând tractul respirator. În special, țesuturile animalelor tratate (panourile G – I) prezintă o acumulare de lipide semnificativ mai mici decât cea a animalelor de control ASMKO netratate.În figura 5, o reducere a materialului de depozitare în măduva spinării animalelor tratate este arătată printr-o culoare albastră Azure II-metilen.

Imagine

non-SNC Histologie. Colorarea cu hematoxilină-eozină de ficat, plămân și splină de controale normale reprezentative (A – C), șoareci de control ASMKO (D – F) și ASMKO (G – I) tratați la 5 luni după transplant (mărire inițială × 200).

Imagine de dimensiune completă

Imagine

Histologia măduvei spinării. ASMKO Mouse Cabluri spinării ASMKO (A) în vârstă de 5 luni și Mouse Asmko (B) transplantat. Săgețile indică granule extrem de bazofile în citoplasma motorului de șoarece ASMKO. Rețineți reducerea acestui material în animalele transplantate.

Imagine de dimensiune completă

Pentru a studia efectele HSCGT asupra pierderii celulelor PUKINJE (PC) care apare la șoarecii ASMKO , Am comparat secțiunile creierului controlate și tratate (transplantul de 5 luni), cu un antiser de calbindină, o proteină de legare a calciului exprimată exclusiv în PC (Figura 6). ) Rețineți pierderea PC-ului marcat într-un control ASMKO netratat (panoul A) în raport cu o secțiune reprezentativă a unui șoarece tratat (panoul B). Într-adevăr, un singur lobul cerebelum arată o colorare a PC-urilor în Animalul ASMKO netratat, în timp ce PC-urile sunt prezente pe șoarecii tratați cu creierul și șoarecii normali de control de iradiere. Această cifră arată, de asemenea, că procedura de iradiere sub-locuință (200 cgy) utilizată pentru a facilita transplantul de celule de transplant nu a afectat dezvoltarea și distribuția PC-urilor în cerebelul obișnuit de animale.

Imagine

imunohistochimie a celulelor Purkinje. Tăierea Sagitală a ASMKO (a) în vârstă de 5 luni, transplantată ASMKO (B) și controlul normal de iradiere (C) cerebella. Rețineți că celulele Purkinje sunt prezente într-o extensie mult mai lungă a cerebelului de șoarece tratat cu șoareci netratați.

Imagine de dimensiune completă

Discuție

Scopul acestui lucru Studiul a fost acela de a determina dacă HSCGT ar putea fi o abordare terapeutică eficientă pentru NDP-uri de tip A și / sau B. Modelul de șoarece NPD (ASMKO) are o patologie a sistemului nervos central și visceral. Foarte similar cu cel al pacienților cu PND uman și este un sistem excelent pentru evaluarea acestei strategii terapeutice și altele. Am raportat anterior rezultatele BMT la șoarecii ASMKO, 1718 și am descoperit că un regim precondiționat de precondiționare la animalele nou-născuți ar putea duce la transplant de nivel înalt, fără a crește mortalitatea sau artefactele patologice. În plus, am demonstrat o modificare semnificativă, dar incompletă a fenotipului la șoareci tratați. În special, fenotipul histologic a fost îmbunătățit semnificativ în organele reticulo-endoteliale, iar apariția ataxiei a fost întârziată (în același timp ca o reținere sporită a neuronilor PC), dar toate animalele tratate au dezvoltat în cele din urmă simptome neurologice. Și a murit prematur .

HSCGT are mai multe avantaje potențiale față de BMT la pacienții cu PND uman, inclusiv faptul că celulele de transplant nu trebuie neapărat să fie derivate din donatorii normali sau heterozigoși compatibili HLA.. În plus, celulele autologate transducate pot supraexprima transgenele, ceea ce duce la un răspuns terapeutic crescut. În acest studiu, activitățile ASM WBC mai mari decât cele normale au fost obținute de la mai multe animale tratate în perioada de aprobare de 10 luni. și descoperirile biochimice în organele viscerale și neurodegenerarea întârziată, toți șoarecii transplantați au dezvoltat în cele din urmă o ataxie și au murit prematur.

Trebuie remarcat faptul că ratele de grefă obținute prin protocolul terapiei genice. Așa cum a fost determinat de hibridizarea in situ Cu o sondă specifică a cromozomului Y, au fost mai mici decât cele obținute de BMT17, în ciuda faptului că procedura de transplant (de exemplu, numărul de celule, iradiere) a fost aceeași. Aceste rezultate evidențiază câteva diferențe importante între cele două abordări terapeutice.De exemplu, în timpul transplantului normal de măduvă osoasă, nu a fost efectuată o manipulare a celulelor, adică conținutul total al celulelor măduvei osoase luate din oasele normale ale donatorului a fost transplantat fără cultivare celulară sau divizarea. În protocolul de terapie genică, o populație de celule mononucleare, izolată de centrifugarea discontinuă cu gradient de densitate, a fost menținută în cultivare timp de 2 zile în prezența factorilor de creștere și transducă cu vectorul retroviral. Acest lucru poate explica cele mai scăzute niveluri de grefă.2021

Cu toate acestea, în ciuda unui transplant mai mic, nivelurile mai ridicate de activitate enzimatică au fost în general detectate în GBS și organele de organe tratate cu terapie comparativ cu cei care primesc a TMO. Aceste date sunt în concordanță cu cele ale altor cercetători care au arătat o expresie pe termen lung și ridicată a transgenelor la șoareci sau șobolani grefate cu celule hematopoietice transducate de MFG.222324 în conformitate cu expresia enzimelor ridicate, o corecție aproape completă. Reticulo- Sistemul endotelial Patologia sistemului, care a fost observată numai atunci când transplantul de transplant de transplant a permis obținerea unui transplant de nivel înalt (care este de a spune > 90%) 18, la animale Tratate cu terapie genică grefate la 30% sau mai puțin.

Pierderea neuronilor PC în NPD Cerebelul de șoarece poate fi una dintre caracteristicile majore ale patologiei lor SNC91825. Este, de asemenea, cauza probabilă a ataxiei progresive, care în cele din urmă duce la moarte. Sa raportat că ceramidele au fost un factor critic în supraviețuirea neuronilor PC-ului cerebelan.26 Inhibarea sintezei de ceramide a provocat o scădere a supraviețuirii celulare, însoțită de o inducție a morții celulare apoptotice și o diferențiere dendritică aberantă a PC-urilor, fără modificarea detectabilă a altor leziuni cerebeloase. Neuronii.26 Pe de altă parte, în timpul expunerii la sfingomelinase bacteriană, supraviețuirea și ramura dendritică a PC-ului a crescut, probabil datorită producției crescute de ceramide. Pentru a monitoriza pierderea neuronilor PC în creierul animalelor tratate cu ASMKO, am efectuat o imunohistochimie folosind un antiser cu calbindină. Calbindine D28K aparține familiei mari de mână EF, presupuse să lucreze, parțial, ca un tampon calic citosolic. Acesta codifică o proteină de legare a calciului exprimată în cerebelul exclusiv în PC.272829. Luna după transplant, a existat o creștere a numărului de PC-uri la șoareci tratați cu șoareci de control iradiat iradiat. Aceste rezultate au fost cel mai probabil datorită prezenței în SNC a celulelor micogly derivate din măduva osoasă și transducă prin mijloace retrovirale capabile să secrete MSA în cantități suficiente pentru a întârzia moartea celulară specifică a bolii în neuronii PC-ului. Rezultate similare au fost observate în studiile noastre privind BMT.18 Este, de asemenea, interesant de remarcat faptul că aceste rezultate au fost obținute în ciuda faptului că nici o creștere detectabilă a activității AȘM nu a putut fi văzută în omogenatele creierului. Animalele tratate. Acest rezultat este în concordanță cu faptul că foarte puține celule derivate ale donatorului au fost capabile să traverseze bariera hemato-encefalică după iradierea subletului și un transplant 17 și să indice că nivelurile foarte scăzute ale MSA sunt suficiente pentru a întârzia moartea CP. , fără a le avertiza.

Deci, ca BMT alogene, HSCGT apare ca o opțiune terapeutică viabilă pentru NPD tip B. Este deosebit de remarcabil faptul că efectele histologice / clinice echivalente au fost obținute la momentele Procedurile BMT și HSCGT, în ciuda faptului că au fost obținute niveluri de grefă mai scăzute. Acest rezultat, asociat cu faptul că nevoia de ambalaj imunosupresor este redusă considerabil în timpul transplantului de celule autologice cu privire la celulele alogene, consolidează ideea că HSCGT poate constitui un tratament adecvat pentru pacienții cu NPD tip B tip B de tip B de tip B Cu toate acestea, trebuie remarcat faptul că, în ciuda acestor rezultate încurajatoare în modelul murin, obținerea acelorași rezultate la pacienții umani este acum problematică, deoarece vectorii de transfer de genetică disponibilă în prezent nu sunt capabili să traducă în mod eficient celulele stem hematopoietice umane. Astfel, BMT alogeneic rămâne singura opțiune terapeutică disponibilă pentru persoanele cu tipul NPD B.În ceea ce privește PND-ul de tip A, datele indică faptul că nivelurile scăzute de exprimare a AȘM în SNC pot duce la îmbunătățiri neurologice parțiale, dar este puțin probabil ca BMT, previne evoluția rapidă și neurodegenerativă a acestei boli. Astfel, trebuie dezvoltate noi abordări pentru a îmbunătăți distribuția celulelor transplantate în SNC și / sau creșterea expresiei AȘM derivate din vectorul din creierul NPD tip A pentru un tratament eficient. P.>

Retroviral Construcția vectorială și prepararea celulelor producătoare de amfotropi

Vectorul retroviral ASM / MFG a fost construit prin introducerea ADNcului ASM uman cu lungime întreagă (HASM) în vectorul MFG așa cum a fost descris anterior .30 în scurt, PCR Mutageneza a fost utilizată pentru a introduce un situs de restricție NCOL în codonul de inițiere al traducerii tipului hasm natural pentru a optimiza traducerea și pentru a facilita clonarea. Pentru a genera linii celulare de pachete retrovirale amfotropice, vectorul ASM / MFG a fost co-electroporat cu plasmidă PSV2neo în celulele de ambalare amfotropice EMPAM1231 și supus unei selecții de G418. Mediile au fost colectate din clonele individuale ale celulelor producătoare virale, iar clona producătoare care duce la cea mai mare activitate ASM după translascarea celulelor NIH-3T3 a fost utilizată pentru experimentele ulterioare. Titlul clonei de producători a fost estimat prin măsurarea creșterii activității AȘM obținute după transducția celulelor NIH-3T3 cu diluții seriale ale mijlocului celulelor producătoare, precum și de blotul sudic. Metode similare de estimare a titlurilor bazate pe activități enzimatice au fost publicate pentru mai multe vectori MFG în absența unui sistem de marker selectabil.3233

Prepararea celulelor producătoare ecotropice

pentru a pregăti eco-ul -Producerea celulelor, linia de celule producătoare amfotropice cu cel mai mare titlu a fost cultivată la o confluență de aproximativ 80% în mediul de vultur modificat al Dulbecco (DMEM, Gibcobrl, Gaithersburg, MD, Statele Unite) care conține 20% vițel fetal ser și antibiotice. După 24 ore, mediul a fost recoltat, concentrat folosind 300 K Pall Filtron Corporation, dealuri de est, NY, Statele Unite), combinate cu medii proaspete care conțin antibiotice și polibubere. 8 μg / ml (Sigma, St Louis, Mo, Statele Unite) . Procesul a fost repetat de trei ori pe o perioadă de 3 zile, apoi celulele producătoare de etificare transducate au fost recoltate și diluate la o concentrație finală de 100 de celule pe zi. 10 ml pentru replicarea și clonarea ulterioară. ADN-ul a fost preparat din clone de celule ecotropice individuale și a fost supus PCR cantitativ (vezi mai jos), iar clona cu cel mai mare număr de copii provizioase a fost reținută și utilizată pentru transducția celulelor. Asmko mouse-ul osoase.

Pregătirea celulelor donatoare

Colonia de șoarece ASMKO a fost stabilită din perechi de reproducere heterozigotă obținute prin direcționarea genei celulelor stem embrionare 129 / SV și prin microinjecție în șoarecii ASMKO C57BL / 6.9 (cu vârsta cuprinsă între 8 și 12 ani săptămâni) au fost folosite ca o sursă de celule donatoare. Pentru a obține celule de măduvă osoasă nucleată, animalele donatoare au fost pre-tratate cu 5fu (150 mg / kg) 48 ore înainte de moarte prin dislocarea cervicală. Celulele măduvei osoase au fost recoltate din tibia și femur prin clătirea cavităților coloanei vertebrale cu o soluție tamponată (10 pmol / ml hepes, pH 7, 5) și un ac de calibru de 27. Suspensii monocelulare au fost obținute prin trecerea celulelor printr-un 40 μm sita de celule nailon (Becton Dickinson Labwares, Lacurile Franklin, NJ, SUA). Celulele măduvei osoase cu densitate redusă (< 1, 085 g / cm3) au fost izolate prin centrifugarea gradientului densității discontinue folosind Nycoprep (Nycomed Pharma ca, Oslo, Norvegia) 35 și spălat cu o soluție de hanks tamponată care conțin 5% ser fetal de vițel inactivat la căldură. Celulele au fost apoi numărate, diluate cu concentrația dorită și transduceri retroviral așa cum este descris mai jos.

Transducția retrovirală a celulelor măduvei osoase

Supernatantele virusurilor eCotionale au fost concentrate folosind tuburi de filtru de 300k macrosep conform instrucțiunilor producătorului.Pentru a realiza transducția retrovirală, celulele măduvei osoase de la 1 x IO9 de la donatorii de sex masculin ASMKO au fost cultivate timp de 48 de ore în 10 ml DMEM conținând vectorul retroviral ecotroope / MFG, 20% ser de vițel fetal inactivat de căldură și antibiotice. Culturile conțin, de asemenea, CSF (50 ng / ml), IL-3 (20 ng / ml), IL-6 (10 ng / ml) (Genzyme, Cambridge, MA, SUA) și 8 μg / ml Polybrene.36373839. În primele 24 de ore, mediul a fost înlocuit cu un mediu proaspăt care conține virusul nou recoltat și concentrat, factorii de creștere proaspătă și poliabray.

Analiza PCR pentru a detecta vectorul ASM / MFG

S-a folosit o modificare a procedurii noastre descrise anterior.30 Secvențele ASM umane endogene MWG și MFG au fost amplificate folosind un primer de simț comun, exon 3 ‘Tgctgagggggaggaga caa -3′ (P1), construit din ASM uman și murin exon 3 , și două primeri antisense specifice speciilor, 5’-ggggagggacagaagattga-3 ‘(p2) și 5′-ggcacaagagacag-3’ (p3), construite din mouse-ul și asmul ASM uman ASM 6, respectiv. Perechii P1 și P2 au amplificat un produs genomic genomic murdar de 211 pb, în timp ce perechile PL și P3 au amplificat un produs de 554 bp de la vectorul MFG specific omului. Fiecare reacție de amplificare (aproximativ 100 pl de volum final) conține 200 pmol de grunduri P1, 100 pmol P2 și P3, 300 ng ADN genomic, 1x tampon PCR, 1, 5 mm de MgCI2, 5U Taq Polimeraza (Promega, Madison, Wi, SUA) și 200 m m fiecare de DNTP. O curbă standard a fost generată utilizând amestecuri de ADN așa cum s-a descris mai sus.20 După amplificare (30 cicluri, fiecare cuprinzând 1 minut la 93 ° C, 61 ° C și 72 ° C), produsele PCR au fost separate prin electroforeză pe o soluție de agaroză la 1, 5%. Geluri și colorate cu bromură de etidiu. Intensitatea benzilor a fost determinată utilizând pachetul software NIH Iager.

transplant transplant transplant

treizeci și două de șoarece ASMKO mai vechi de 2 zile au fost utilizate ca receptoare. Înainte de primirea transplantului, destinatarii au fost supuși unei singure doze de iradiere totală a corpului de 200 cgy dintr-o sursă dublă de 137 CS (rata dozei, 80 cgy / min). Fiecare animal a primit un total de 1 × 106 celule / g greutate corporală injectată intravenos. S-au folosit tovarășii de aceeași vârstă (normal și ASMKO, N = 5 pentru fiecare) ca indicatori de iradiere (adică iradiați, dar nu transplantați). Animalele au fost menținute conform unui ciclu de lumină / întuneric de 12 ore, apă la voință și purină pentru rozătoare Purina 5001. Nu s-au administrat antibiotice sau alt tratament suport la oricare dintre animale înainte sau după transplantare.

Evaluarea post-grefă

Greutățile animalelor transplantate și cookie-urilor au fost înregistrate lunar. Sângele periferic a fost obținut de asemenea prin sângerarea orbită retinală pentru o analiză lunară a enzimelor în celulele albe din sânge (WBC) (vezi mai jos).

Hibridizarea in situ a cromozomului Y

Probele de sânge au fost luate la 5 luni după transplant pentru a estima transplantul în receptoare. WBC-urile au fost izolate cu ajutorul unui tampon hemolitic (NH40, 1 M, NaHC03 12 M, EDTA 10 M M, pH 8, 0), fixat într-o soluție carnooy (acid metanol-acetic 3: 1) și plasat pe lame de microscop . Celulele au fost tratate cu HCI 0, 1 M conținând 0, 05% triton X-100 timp de 7, 5 minute la 37 ° C, fixat în paraformaldehidă tamponată 1% (pH 7, 4) timp de 15 minute până la 24 ° C deshidratat în etanol. Hibridele au fost efectuate prin incubarea lamelor peste noapte într-o cameră umidificată la 37 ° C cu o soluție (2x SSC, 50% formamidă, 10% sulfat de dextran, 0, 1% Tween 20, 0, 5 mg / ml de ADN spermă de somare ) conținând 4 ng / pl dintr-o sondă specifică a senzorului de șoarece biotinilat (M34) .40 După hibridizare, lamele au fost spălate și dezvoltate utilizând o avidină conjugată fluoresceină (5 μg / ml) (Sigma, St Louis, Mo, SUA ), urmată de amplificarea cu anti-avidină biotinilată (2 μg / ml) (laboratoare vectoriale, burlingame, ca, SUA). Apoi, a fost efectuată oa doua incubare / amplificare cu conjugat fluorescein-avidină pentru a maximiza sensibilitatea detectării. Celulele au fost apoi contra-colorate cu iodură de propidiu (100 pg / ml) (Sigma) și montate într-un mediu anti-grove (Tris-HCI 10M pH 7, 5 conținând 20 mg / ml de DABCO (trietilendiamină – 1, 4-diazabiciclo octan; sigma) în glicerol). 300 de nuclee au fost marcate pentru a determina procentajul celulelor derivate ale donatorilor din sângele altoit.

Testul imunotematic enzimatic (ELISA) și imunoprecipitarea

Pentru a detecta prezența anticorpilor îndreptați împotriva HPS-ului recombinant exprimat, dozele ELISA au fost efectuate pe plasmă de la șoareci tratați și netratați. Hasmul purificat a fost incubat timp de 18 ore în plăci de microtitrare cu 96 de godeuri. Godeurile au fost spălate de 3 ori cu tamponul de spălare 1 (WB1, Tris 10M, pH 7, 5, NaCI 150 mm, Tween 20 0, 05%), apoi blocat timp de 1 oră cu BSA la 3% în PBS la temperatura camerei . S-au adăugat diluții cu plasmă de șoarece tratate și netratate în WB1 (100 pl la o diluție de 10 -2, 10 -3, 10 -4) la godeuri și incubate la 37 ° C timp de 3 ore. Godeurile au fost spălate de 3 ori cu WB1, apoi s-au adăugat 100 pl de anti-șoarece anti-șoarece (SIGMA) (1: 500 de diluție 1: 500 în WB1) și o incubare de 2 ore la temperatura camerei la temperatura ambiantă. Godeurile au fost spălate din nou de 3 ori cu WB1 și de 2 ori cu tamponul de spălare 2 (10 mM pH 7, 5, NaCI 150 mm). Un substrat de peroxidază a fost apoi adăugat la godeuri (100 ft) și incubat la temperatura camerei timp de 30 de minute. Un cititor automat de plăci ELISA a fost utilizat pentru a determina absorbția la 405 nm.

Testele de imunoprecipitare au fost utilizate pentru a determina dacă anticorpii prezenți la șoarecii tratați au inactivat enzima exprimată. O soluție de 500 U de hasm, 1 ml de PBS, 10 pl de plasmă de șoarece (tratat sau indicator) și 1 mg / ml de BSA au fost incubate timp de 18 ore la 4 ° C pe o roată rotativă. Apoi, s-au adăugat 100 pl de proteină G G-Sepharose la 1: 1 în PBS la soluție și s-au incubat timp de 4 ore la 4 ° C după centrifugare la 14 000 rpm timp de 2 minute, activitatea AȘM în supernatanți și pelete a fost Analizat SPM) 41, cu excepția acidului bodip dodecanoic (sonde moleculare, Eugene, Gold, SUA) condensat cu sphingosil fosfocholine. Scindarea DBO12-SPM de către AȘM eliberează ceramidă fluorescentă, care poate fi cuantificată după separare prin CCM sau extracție organică. WBC-urile sau țesuturile au fost obținute așa cum s-a descris anterior18 și omogenizate în Triton X-100 până la 0, 2% pe gheață folosind trei 10 secunde de omogenizator de țesături Potter-Elvehjem (Thomas Scientific, Swedidesboro, NJ, SUA). Proteina totală a fost determinată de metoda lui Stein et al.42. Amestecul de testare standard cu 15 pl a constat din 10 pl de probă (celule omogenizate sau țesături) și 2 nmol de DBO12-SPM suspendat în tampon de acetat de sodiu 0, 1 m, pH 5, 2., conținând 0, 6% Triton X -100 și fie 5 mM EDTA (pentru detectarea activității ASM dependente non-zinc), fie ZnCI2 0,1 mm (pentru detectarea activității L ASM stimulată de zinc) .43 după incubarea amestecului de testare la 37 ° C (în sus La 3 ore), probele au fost încărcate pe plăci de cromatografie în strat subțire (silicagel TK LK6 D 60, Whatman, Clifton, New Jersey, Statele Unite) și rezolvate folosind un amestec de cloroform / metanol (95: 5 v / v). După rezoluție, banda conținând ceramida marcată cu fluorescență a fost răzuită din plăcile CCM, extrasă într-o amestec de cloroform / metanol / apă (1: 2: 1 v / v) timp de 15 minute la 55 ° C și cuantificată într-un spectrofluorometru. ( 204 – Un spectrofotometru de fluorescență, Perkin Elmer). Instrumentul a fost setat la limite de undă de excitație și de emisie de 505 și respectiv 530 nm Țesuturile (creier, ficat, plămân și splină) au fost omogenizate într-un amestec de cloroform / metanol (1: 2 v / v) pentru o vedere. Extragerea lipidicelor. O hidroliză fosfolipidă alcalină a fost efectuată pe probe hepatice, pulmonare și splină în KOH 0, 4 N / metanol la 90% timp de 2 ore până la 55 ° C pentru a preveni interferențele plasmolifane și a altor fosfolipide în extractele creierului, a fost efectuată o hidroliză acidă Pe aceste eșantioane utilizând HCI 0, 6 M în etanol timp de 30 min la 37 ° C înainte de hidroliza alcalină. După hidroliză, probele au fost incubate cu acid percloric (70%) timp de 40 minute la 180 ° C, apoi tratați cu molibdat de amoniu la 0, 5% și un reductor de fiske și subdazaw (4 mg / ml; sigma) timp de 10 minute la 10 minute 100 ° C. Absorbanța la 830 nm a fost măsurată într-un spectrofotometru (modelul 1201, Milton Roy Spectronic, Rochester, NY, SUA).

Pregătirea țesutului pentru histologie

Șoarecii au fost anesteziați cu ketamină (sigma; 0, 5 g / kg greutate corporală) și sub rezerva perfuziei cardiace. O incizie a fost făcută în atriul drept pentru a permite fluxului de sânge și o canulă a fost introdusă în aorta prin ventriculul stâng, livrând 50 ml dintr-o soluție fierbinte la 0, 9% NaCI. Probele de țesut pentru microscopia optică au fost fixate în formalol tamponat de 10%, incluse în parafină, tăiate în tăietură și colorată la hematoxilină și eozină. Probele SNC au fost prelevate după perfuzarea glutaraldehidăului, după-amiază în tetroxidul de osmoză, încorporați într-un epon, tăiat tăiat și colorat cu metilen albastru II.

Purkinje Imunodetectie celulară.

Țesuturile au fost Fixat prin perfuzie vasculară cu formaldehidă tamponată 4% (de la paraformaldehidă) și 50 μm tăieturi au fost obținute de la cerebinul de vibratom. Secțiunile au fost tratate cu peroxid de metanol / hidrogen pentru a îndepărta activitatea peroxidazei endogene, blocată cu o soluție la o capră normală de 10% și un ser normal de fundal 10%, cu bovină serică serică de 1%, la 0, 1% gelatină și 0, Azidă de sodiu 01% în PBS, urmată de un tratament de 18 ore de incubare cu antiser anti-calbindină de iepure (Sigma) (diluare 1: 5000 preparată în același tampon). Cuturile au fost apoi spălate timp de 4 până la 8 ore în PBS și incubate timp de 18 ore într-un imunoreactiv diluat anti-iepure compus dintr-un fragment FAB2 conjugat la peroxidază (înalt în măgar), absorbit absorbit pentru a nu reacționa la imunoglobinele de șoarece (Amersham) . După 4 până la 8 ore de spălare, tăieturile au fost dezvoltate într-un amestec standard de hidrogen, uscat și lamelat.

Analize statistice

Analiza Kaplan – Meier Actuarial (Figura 2) a fost efectuată Utilizarea sistemului statistic de asistare a confiscării și recuperării datelor pacientului (Casper). Pentru datele ilustrate în figurile 1 și 3, valorile medii sunt reprezentate grafic cu erorile standard ale mediei. Valorile P au fost calculate utilizând un test t asociat.

Confirmări

Această lucrare a fost finanțată de granturi de cercetare de la Institutul Național de Sănătate (HD 28607 și HD 32654), de la Înființarea malformațiilor congenitale martie a Dimes (1-2224), o subvenție (RR 0071) a Centrului Național de Cercetare de la Muntele Sinai. Centrul de Cercetare Clinică Generală și un grant (93-00015) al Fundației științifice americane-israeliene. Am dori să le mulțumim Dr. Lalji Singh, centrul de biologie celulară și moleculară (India) pentru furnizarea sondei specifice a cromozomului Y.

Be First to Comment

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată. Câmpurile obligatorii sunt marcate cu *