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terapia genica por células madre hematopoyéticas Conduce a una clara mejora de los órganos viscerales y la aparición tardía de las anomalías neurológicas en el modelo murino de la enfermedad de Niemann, deficiente en la eliminación de la esfingomielinasa ácida

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abstracto

Niemann – Tipo de selección (NDP) Las enfermedades del tipo A y B se deben a partir de la actividad deficiente de la esfingomielinasa ácida (ASM). Actualmente, no hay tratamiento disponible para una u otra forma de NDP. Utilizando el modelo de Mouse Knockout de ASM, evaluamos los efectos de la terapia génica de células madre hematopoyética ex vivo en el fenotipo NDP. Treinta y dos ratones de ASMKO recién nacidos se han precedido con una radiación de dosis baja (200 cgy) y trasplantadas con las células de médula ósea de Asmko que se han transducido con una codificación de vectores retrovirales ecotrópicos para el ASM humano. El trasplante de células derivado de los donantes varió de 15 a 60% sobre la base del análisis de hibridación in situ en glóbulos blancos periféricos y se llevó a cabo en el 92% de los animales injertados. Se han encontrado altos niveles de actividad de ASM (hasta cinco veces mayor de lo normal) en animales injertados hasta 10 meses después de que el trasplante y la duración de la vida se han extendido en un promedio de 5 a 9 meses por el procedimiento de terapia de genes. Los análisis bioquímicos e histológicos de las telas obtenidas de 4 a 5 meses después del trasplante mostraron un aumento de las actividades de ASM y una reducción significativa en el almacenamiento de la esfingomielina en los ratones tratados con bazo, hígado y pulmones, sitios patológicos principales del tipo NDP B. el La presencia de las neuronas celulares de Purkinje también aumentó significativamente en el grupo tratado en comparación con los animales no procesados 5 meses después del trasplante, y se ha observado una reducción en la memoria de las neuronas de la médula espinal. Sin embargo, todos los ratones injertados terminaron desarrollando una ataxia y murieron antes de los ratones normales. En general, estos resultados indican que la terapia germinal del vástago hematopoyético debe ser eficaz para el tratamiento de NDD Tipo B no neurológico, pero que se deben mejorar las técnicas mejoradas para las células de injerto y / o enzimas en sitios patológicos específicos. El sistema nervioso central debe ser mejorado. Desarrollado para obtener un tratamiento efectivo de un tipo NDP.

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Introducción

Niemann – Pick (NPD) La enfermedad del tipo A y B son dos clínicamente distintos Formas de un trastorno de almacenamiento lisosomal causado por la deficiencia hereditaria en la esfingomielinasa ácida (ASM; EC 3.1.2.2.12). Actividad.123 Tipo A NDP se manifiesta por un retraso en el desarrollo, la hepatospplenomegalia y una evolución neurodegenerativa rápida progresiva que generalmente lleva a la muerte a los 3 años. Por otro lado, el tipo B NDP se caracteriza por la hepatosplenomegalia, los infiltrados pulmonares que conducen a infecciones respiratorias frecuentes, la participación neurológica mínima o cero y la supervivencia de los adolescentes o adolescentes. Spingomielin y el colesterol se acumulan en pacientes con los dos fenotipos NDP, pero los mecanismos fisiopatológicos específicos que subyacen a su distinta evolución clínica siguen siendo desconocidos.

En los últimos años, el cDNA y los genes ASM humanos y murinos se han aislado y expresado, 4567 Se han identificado las enfermedades que causan enfermedades8 y los modelos murinos inactivables se han producido910. Las características clínicas, bioquímicas y patológicas de la deficiencia en ASM (ratones ASMKO) imitan los ndps de tipo A y B, ofreciendo así la posibilidad de obtener nueva información sobre la patogénesis de la enfermedad y desarrollar y evaluar nuevos enfoques terapéuticos.

Actualmente, no hay un procesamiento disponible para una u otra forma de NDP. El trasplante hepático en un hombre con un tipo de NPD A no ha tenido éxito en 1112 y, aunque se han reportado las pruebas de trasplante de trasplante de membrana amniótica y trasplante de médula ósea, solo se estudió un pequeño número de pacientes humanos.

contrariamente a Estos estudios en humanos, un análisis completo del BMT se llevó a cabo en el ratón asmko1718. Esta técnica ha llevado a una mejora en la vida, mejoras histológicas y bioquímicas de varios órganos clínicamente importantes, incluido el hígado y el bazo, y una aparición de fenotipo neurológico.Por lo tanto, el uso de BMT alogénico para el tratamiento del NDP de tipo B se basa científicamente, pero se complica por la falta de donantes de hermanos y hermanos completamente compatibles en la mayoría de las familias NDP, la morbilidad y la mortalidad asociadas con el uso de la irradiación corporal total y Reactivos inmunosupresores., así como la enfermedad del injerto contra el huésped (GVHD).

El injerto autólogo de células de médula ósea modificada genéticamente (terapia génica por células madre hematopoyéticas, HSCGT) es, por lo tanto, una alternativa razonable a la TMO alogénico para el tratamiento de esta enfermedad.19 Elimina los dos problemas principales de disponibilidad de donantes y GVHD, looréticamente que conduce a una disminución de la morbilidad y la mortalidad. Además, las células corregidas obtenidas enzimáticamente por transferencia de genes pueden expresar / secretar la enzima a niveles mayores que los que se encuentran en las células normales, tal vez conducen a una eficiencia clínica mejorada.

experimentos. Se han realizado en este manuscrito. Para evaluar si el trasplante de dosis bajas con células hematopoyéticas de transducción retroviral podría llevarse a cabo a largo plazo, y si el trasplante de estas células en los ratones recién nacidos de Asmko podría tener efectos terapéuticos. Además, comparamos la efectividad de este enfoque terapéutico con los resultados obtenidos previamente por el trasplante de células normales de médula ósea (es decir, BMT).

Trasplante y injerto

treinta y dos asmko Los ratones recién nacidos (2 días de edad) se han trasplantado con 1 × 10 6 células de médula ósea que se han transducido con un vector retroviral ASM / MFG ECOTROP (ver Materiales y métodos para más detalles). La irradiación del cuerpo total SucbleTale (200 cgy) se ha utilizado para facilitar el trasplante con las células donantes masculinas, de modo que los niveles de socket de trasplante se puedan evaluar en los destinatarios mediante hibridación in situ utilizando una sonda específica del cromosoma Y17. Cinco meses después del trasplante, el WBC de los donantes se detectó en el 92% de las hembras trasplantadas y el porcentaje de estas células (es decir, el injerto) varió entre 15 y 60%, porcentaje de zócalo de injerto ligeramente inferior a la obtenida previamente por BMT17. Se determinó que todos los animales injertados eran positivos para la presencia de secuencias de vectores en sus glóbulos blancos periféricos 3 y 8 meses después del injerto utilizando un método de detección de PCR (no presentado).

Actividades ASM en el WBC de Asmko Mouse injertado

Las actividades de ASM WBC se midieron mensualmente en animales individuales después del procedimiento de trasplante. Como se muestra en la Figura 1, los ratones de Asmko tratados tenían actividades de ASM significativamente más altas que sus rangos normales (P< 0, 002). Los ratones de Asmko no tratados tienen < 1% de la actividad Normal ASM WBC.9 de 1 mes y hasta el quinto mes después del trasplante, los niveles de actividad de la actividad de la CMB ASM en Tratados Los animales aumentaron gradualmente y se estabilizaron después. Sin embargo, no se observó una correlación directa entre la actividad de la CMB de ASM y la supervivencia (ver Figura 2 a continuación) al analizar animales.

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ASM Actividades en el WBC tratado a Asmko y control de animales. Las muestras de sangre de la órbita de la retina se tomaron cada mes después de que se realizaron los ensayos de actividad de trasplante y ASM en el CMB, como se describe en materiales y métodos. El gráfico muestra los valores promedio y los errores estándar de los ratones medios medios (▪), Asmko (•) y Asmko () trasplantados. N = 32 para Asmko injertado y cinco para los animales de control normal y Asmko sometidos a irradiación. Tenga en cuenta que los animales de control de Asmko no tratados han sobrevivido solo hasta la edad de 6 meses.

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Kaplan – Meier Diagrama que muestra una mayor supervivencia de los ratones de Asmko presentados a HSCGT. Normal (▪), Asmko (•) y Asmko trasplantado ().

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Muestras de suero inyectadas fueron analizadas por ELISA para la presencia de anticuerpos anti-hasm e inmunoprecipitación para Determine si estos anticuerpos desactivaron la actividad enzimática. Todos los animales injertados con éxito tenían niveles medibles de anticuerpos anti-hasm en su plasma, pero en todos los casos, estos anticuerpos no inhibieron la actividad inmunoprecipitada de ASM (es decir, no están neutralizando, no se representan).

Supervivencia y crecimiento de los ratones de asmko injertados

Los efectos del procedimiento de terapia génica sobre la supervivencia de los ratones de Asmko se demuestran en el análisis de Kaplan-Meier que se muestra en la Figura 2. La vida de Los animales testigos de la irradiación de tipo salvaje (es decir, irradiados pero no trasplantados) fueron normales (> 1 año). ), mientras que todos los ratones de Asmko sometidos al control de la irradiación murieron entre 6 y 7 meses (edad promedio al Death 6, 4 meses). Se observó una mayor longevidad en animales tratados con terapia génica. Por ejemplo, a los 8 meses posteriores al trasplante, aproximadamente el 75% de los animales tratados con ASMKO sobrevivieron, mientras que 10 meses después del trasplante, este número se redujo al 40%. Sin embargo, a pesar de su mayor vida, la ataxia se ha hecho evidente en los ratones trasplantados alrededor de los 6 meses y todos los animales tratados (con la excepción de los que se han puesto a muerte con fines experimentales), finalmente murieron a la edad de 1 año. . Antes de los 6 meses de edad, los esquemas de tratamiento del grupo de tratamiento eran similares a los del grupo de control normal, pero luego perdieron peso y siguieron una evolución neurodegenerativa similar a la de los ratones de Asmko. Por lo tanto, el procedimiento de terapia génica retrasó la aparición de síntomas neurológicos, pero no los detuvo.

Actividad de ASM y contenido de esfingomielina en los órganos

cinco meses después del tratamiento, un grupo de Se han puesto a muerte seis animales injertados (así como tres animales de control normales y afectados) e infundidos con solución salina para imponer la sangre de los órganos. Los hígados, las ratas, los pulmones, los riñones, los corazones y los cerebros se diseccionaron y se congelaron. ASM Los niveles de actividad y los contenidos de esfingomyeline se han evaluado en estos órganos y los resultados se muestran en la Figura 3. Se debe tener en cuenta que los niveles de actividad de ASM en el bazo, el hígado y los pulmones de los animales de Asmko tratados fueron aproximadamente 90, 65 y 40%. de lo normal, respectivamente, significativamente por encima de los valores encontrados en los animales de Asmko que no se tratan.9 (El valor de P durante la comparación de las actividades de ASM en estos tejidos entre los ratones tratados y no tratados de Asmko fue < 0, 0001.) Por otro lado, los niveles de actividad asm que se encuentran en el cerebro, los corazones y los riñones de los animales tratados no fueron más estadísticamente que los que se encuentran en animales no tratados (valores de P > 0, 1).

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Actividades de ASM y contenido de esfingomyeline en los tejidos de Asmko y los animales de control tratados. (a) Cinco meses después del trasplante, las actividades de ASM se midieron en varios órganos, como se describe en materiales y métodos. El histograma muestra una comparación de las actividades promedio de ASM en animales tratados (n = 6) con las actividades detectadas en los mismos tejidos de control de control normal y envejecido (n = 3). Las líneas verticales indican el error estándar del promedio. (b) los niveles de esfingomielina se midieron en los mismos tejidos que los animales tratados y están representados por el porcentaje de reducción en comparación con los animales de control de ASMKO no se tratan de la misma edad (n = 3).

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De manera significativa, se ha observado una correlación significativa entre los niveles de enzima y la eliminación del sustrato. De hecho, en ratas y hígados, donde las actividades de ASM fueron significativamente altas, la acumulación de esfingomielina se ha reducido a niveles casi normales (el valor de P cuando la comparación del contenido de esfingomiosinas de estos tejidos entre los ratones de ASMKO tratados y normales fue > 0, 1). Se ha observado una situación intermedia en los pulmones, mientras que en el cerebro, los corazones y los riñones, prácticamente no hubo actividad detectable de ASM o reduciendo la esfingomielina.

Efectos patológicos

Figura 4 Un análisis histológico representativo de los cortes de tela de hígado, pulmones y ratas de los indicadores de control de ratón y de irradiación tratados (Asmko y Normal) 5 meses después del trasplante. Tenga en cuenta que alrededor de los 5 meses de edad, los ratones Asmko (F) no tratados tenían un importante almacenamiento de lípidos en comparación con los animales normales (paneles A – C). Muchas células espumantes pálidas se han dispersado en las secciones de hígado y bazo y se ha observado una infiltración significativa de alvéolos y septos en los pulmones, obstruyendo el tracto respiratorio. En particular, los tejidos de los animales tratados (paneles G – i) muestran una acumulación de lípidos significativamente más bajos que los de los animales de control de Asmko no tratados.En la Fig. 5, una reducción del material de almacenamiento en la médula espinal de los animales tratados se muestra mediante un color azul-metileno Azure II.

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Histología no SNC. La tinción con hematoxilina-eosina de hígado, pulmón y bazo de los controles normales representativos (A – C), el control de Asmko (D – F) y los ratones de Asmko (G – I) trataron 5 meses después del trasplante (aumento inicial × 200).

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Histología de la médula espinal. Asmko Mouse Las cuerdas espinales de Asmko (a) Axidan 5 meses y el mouse Asmko (B) trasplantado. Las flechas indican gránulos altamente basófilos en el citoplasma del motor de Mouse Asmko. Tenga en cuenta la reducción de este material en animales trasplantados.

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Para estudiar los efectos del HSCGT sobre la pérdida de células PUKINJE (PC) que se produce en los ratones de Asmko , comparamos las secciones cerebrales controladas y tratadas (trasplante de 5 meses) Immunoreagi con un antisuero de calbindina, una proteína de unión al calcio expresada exclusivamente en PC (Figura 6). ) Tenga en cuenta la pérdida de PC marcada en un control de Asmko no tratado (Panel A) con respecto a una sección representativa de un ratón tratado (Panel B). De hecho, un solo lóbulo de cerebelo muestra una PC para colorear en el animal de Asmko no tratado, mientras que las PC están presentes en todos los ratones tratados con cerebro y ratones normales de control de irradiación. Esta cifra también muestra que el procedimiento de irradiación del subtócalo (200 cgy) que se utiliza para facilitar el trasplante de células trasplantes no ha afectado el desarrollo y la distribución de las PC en el animal normal Cerebel.

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inmunohistoquímica de las células Purkinje. Corte sagital de ASMKO (A) AXD 5 meses, trasplantado a Asmko (B) y control de irradiación normal (C) Cerebella. Tenga en cuenta que las células Purkinje están presentes en una extensión mucho más larga del cerebelo del ratón tratado con ratones no tratados.

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Discusión

El propósito de este El estudio fue determinar si el HSCGT podría ser un enfoque terapéutico eficaz para los NDPS del tipo A y / o B. El modelo de ratón NPD (ASMKO) tiene una patología del sistema nervioso central y visceral. Muy similar a la de los pacientes con NDP humano, y Es un excelente sistema para evaluar esta estrategia terapéutica y otras. Anteriormente, informamos los resultados de BMT en los ratones de Asmko, 1718 y descubrimos que un régimen de preacondicionamiento de supletal en animales recién nacidos podría resultar en un trasplante de alto nivel sin aumentar la mortalidad o los artefactos patológicos. Además, hemos demostrado una alteración significativa pero incompleta de fenotipo en ratones tratados. En particular, el fenotipo histológico se mejoró significativamente en los órganos reticulo-endoteliales y la aparición de ataxia se retrasó (al mismo tiempo, como un aumento de la retención de las neuronas de PC), pero todos los animales tratados finalmente han desarrollado síntomas neurológicos. Y murió prematuramente .

El HSCGT tiene varias ventajas potenciales sobre el BMT en pacientes con NDP humano, incluido el hecho de que las células trasplantadas no necesariamente tienen que derivarse de los donantes normales o heterocigotos compatibles con HLA. Además, las células autólogas transducidas pueden sobreexpresar sobreexpresar al transgén, quizás conduciendo a una respuesta terapéutica aumentada. En este estudio, ASM WBC Actividades mayores de lo normal se han obtenido de varios animales tratados durante el período de finalización de 10 meses. y descubrimientos bioquímicos en órganos viscerales y neurodegeneración retrasada, todos los ratones trasplantados finalmente desarrollaron una ataxia y murieron prematuramente.

Se debe tener en cuenta que las tasas de injerto obtenidas por el protocolo de terapia génica. Según lo determinado por la hibridación in situ Con una sonda específica del cromosoma Y, fueron más bajos que los obtenidos por BMT17, a pesar del hecho de que el procedimiento de trasplante (por ejemplo, el número de células, la irradiación) fue la misma. Estos resultados resaltan varias diferencias importantes entre los dos enfoques terapéuticos.Por ejemplo, durante el trasplante normal de la médula ósea, no se ha llevado a cabo un manejo de células, es decir, el contenido total de las células de la médula ósea tomadas de los huesos de los donantes normales se ha trasplantado sin cultivo celular o división. En el protocolo de terapia génica, una población de células mononucleares, aislada por centrifugación discontinua con gradiente de densidad, se ha mantenido en el cultivo durante 2 días en presencia de factores de crecimiento y se transfujo con el vector retroviral. Esto puede explicar los niveles más bajos de injerto observado.2021

Sin embargo, a pesar de un trasplante más bajo, generalmente se detectan niveles más altos de actividad enzimática en los GBS y los órganos órganos tratados con terapia. Genio en comparación con los que reciben un TMO. Estos datos son consistentes con los de otros investigadores que han demostrado una expresión a largo plazo y alta de transgenes en ratones o ratas injertadas con células hematopoyéticas transducidas por MFG.222324 de acuerdo con la alta expresión de enzimas, una corrección casi completa. De reticulo- Sistema endotelial La patología del sistema, que solo se ha observado cuando el trasplante de trasplante de trasplante ha permitido obtener un trasplante de alto nivel (es decir, para decir > 90%) 18, en animales tratado con terapia génica injertada en un 30% o menos.

La pérdida de las neuronas de PC en la NPD Mouse CereBel puede ser una de las características principales de su patología de SNC91825. También es la causa probable de la ataxia progresiva, que finalmente conduce a la muerte. Se ha informado que las cerámidas fueron un factor crítico en la supervivencia de las neuronas de la PC CEREBELAN.26, la inhibición de la síntesis de ceramida causó una disminución en la supervivencia celular, acompañada por una inducción de la muerte celular apoptótica y una diferenciación dendrítica aberrante de PC, Sin modificación detectable de otras lesiones cerebelosas. Neuronas.26 Por otro lado, durante la exposición a la esfingomielinasa bacteriana, la supervivencia y la rama dendrítica de la PC aumentó, probablemente debido al aumento de la producción de ceramidas. Para monitorear la pérdida de las neuronas de PC en el cerebro de los animales tratados con Asmko, realizamos una inmunohistoquímica utilizando un antisuero con calbindina. Calbindine D28K pertenece a la gran familia de la mano, se supone que funciona, en parte, como un búfer cálcico citosólico. Codifica una proteína de unión a calcio expresada en el cerebelo exclusivamente en PC.272829. Mes Después del trasplante, hubo un aumento en el número de PC en ratones tratados con ratones de control irradiados afectados. Estos resultados fueron más probables debido a la presencia en el SNN de las células microglizantes derivadas de la médula ósea y transducidas por medios retrovirales capaces de secretar MSA en cantidades suficientes para retrasar la muerte celular específica de la enfermedad en las neuronas de la PC. Se han observado resultados similares en nuestros estudios sobre BMT.18 También es interesante observar que estos resultados se han obtenido a pesar de que no se pudo ver un aumento detectable en la actividad de ASM en homogeneos cerebrales. Animales tratados. Este resultado es consistente con el hecho de que muy pocas células derivadas del donante han podido cruzar la barrera hematoencefálica después de la irradiación subletal y un trasplante 17, e indicar que los niveles muy bajos de MSA son suficientes para retrasar la muerte de CP. , sin previo avisarlos.

Entonces, como el BMT alogénico, el HSCGT aparece como una opción terapéutica viable para el Tipo NPD B. Es particularmente notable que se hayan obtenido efectos histológicos / clínicos equivalentes en los tiempos. Los procedimientos BMT y HSCGT, a pesar de que los niveles de injerto más bajos han sido obtenidos por ellos. Este resultado, asociado con el hecho de que la necesidad de envases inmunosupresores se reduce considerablemente durante el trasplante de células autólogas con respecto a las células alogénicas, refuerza la idea de que el HSCGT puede constituir el tratamiento adecuado para los pacientes con NPD. Sin embargo, se debe tener en cuenta que, a pesar de estos resultados alentadores en el modelo murino, la obtención de los mismos resultados en pacientes humanos ahora es problemático porque los vectores de transferencia de genes actualmente disponibles no pueden traducir eficazmente las células madre hematopoyéticas humanas de manera eficiente. Por lo tanto, el BMT alogénico sigue siendo la única opción terapéutica disponible para individuos con Tipo NPD B.Con respecto al tipo A NDP, los datos indican que los niveles bajos de expresión de la ASM en el SNC pueden conducir a mejoras neurológicas parciales, pero es poco probable que, como el BMT, evita la evolución rápida y neurodegenerativa de esta enfermedad. Por lo tanto, se deben desarrollar nuevos enfoques para mejorar la distribución de células trasplantadas en el SNC y / o aumentar la expresión de la ASM derivada del vector en el cerebro del tipo de NPD a para un tratamiento efectivo. P.>

retroviral Construcción vectorial y preparación de células de producción amotrópica

El vector retroviral ASM / MFG se ha construido insertando el ADNc de ASM humano de longitud completa (Hasm) en el vector MFG como se describió anteriormente .30 en corto, PCR La mutagénesis se ha utilizado para introducir un sitio de restricción de NCOC en el codón de iniciación de la traducción del tipo de hasm de naturaleza para optimizar la traducción y facilitar la clonación. Para generar líneas celulares de paquete retroviral amphotrópico, el vector ASM / MFG se desarrolló con co-electroporada con el plásmido PSV2NEO en celdas de embalaje anffotrópico Envam1231 y se sometió a una selección por G418. Los entornos se han recolectado a partir de clones individuales de células productoras virales, y el clon productor que conduce a la actividad más alta de ASM después de la transducción de las células NIH-3T3 se ha utilizado para experimentos posteriores. El título del clon del productor se estimó mediante la medición del aumento de la actividad ASM obtenida después de la transducción de las células NIH-3T3 con diluciones en serie de la mitad de las células productores, así como por la transferencia Southern. Métodos similares para la estimación de valores basados en actividades enzimáticas se han publicado para varios otros vectores de MFG en ausencia de un sistema marcador seleccionable.3233

Preparación de células productoras ecotrópicas

Para preparar ECO -Las células prodicantes, la línea de células de producción amotrópica con el título más alto se cultivó en una confluencia de aproximadamente el 80% en el entorno de águila modificada de Dulbecco (DMEM, GIBCOBRL, GAITHERSBURG, MD, Estados Unidos) que contenía 20% de ternero fetal Serum y antibióticos. Después de 24 h, el medio se recogió, se concentró con 300 k Pall Filtron Corporation, East Hills, NY, Estados Unidos), combinada con antibióticos que contienen medio fresco y Polybubere. 8 μg / ml (Sigma, St Louis, MO, Estados Unidos) . El proceso se repitió tres veces durante un período de 3 días, luego las células productoras ecotónicas transducidas se recogieron y se diluyeron a una concentración final de 100 células por día. 10 ml para la subsiguiente replicación y clonación. El ADN se ha preparado a partir de clones de células Ecotrópicas individuales y se somete a PCR cuantitativa (ver más abajo), y el clon con el mayor número de copias provirus se ha mantenido y se usa para la transducción de las células. Asmko Mouse Thone médula.

Preparación de células donantes

La colonia de ratones de Asmko se ha establecido a partir de pares reproductores heterocigotos obtenidos por la orientación de genes de las células madre embrionarias 129 / sv, y por microinjección en C57BL / 6.9 Blastocysts asmko ratones (de 8 a 12 años. semanas) se utilizaron como fuente de células donantes. Para obtener células de médula ósea nucleadas, los animales de los donantes fueron pretratados con 5FU (150 mg / kg) 48 h antes de la muerte por dislocación cervical. Las células de la médula ósea se cosecharon de las tibias y los fémures al enjuagar las cavidades espinales con una solución de Hank tamponado (10 μmol / ml Hepes, pH 7, 5) y una aguja de 27 calibre. Las suspensiones monocelulares se han obtenido al pasar células a través de un 40. μM Tamiz de células de nylon (Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.). Las células de la médula ósea de baja densidad (< 1, 085 g / cm 3) se aislaron mediante centrifugación de degradado de densidad discontinua utilizando NYCOPREP (NYcomed Pharma como, Oslo, Noruega) 35 y se lavó con una solución de Hanks tamponados que contienen un 5% de suero de ternera fetal inactivado por calor. Luego, las células se contaron, se diluyeron con la concentración deseada y se transduciron retroviralmente como se describe a continuación.

Transducción retroviral de las células de la médula ósea

Los sobrenadantes de virus ecotionales se concentraron utilizando tubos de filtro MACROSEP 300K De acuerdo con las instrucciones del fabricante.Para lograr la transducción retroviral, aproximadamente 1 x Células de médula ósea IO9 de los donantes masculinos de Asmko se cultivaron durante 48 horas en 10 ml de DMEM que contiene el vector retroviral Ecotrope / MFG concentrado, el 20% del suero de becerro fetal inactivado por el calor y los antibióticos. Los cultivos también contenían CSF (50 ng / ml), IL-3 (20 ng / ml), IL-6 (10 ng / ml) (Genzyme, Cambridge, MA, EE. UU.) Y 8 μg / ml de polybrene.36373839. Durante las primeras 24 horas, el medio ambiente fue reemplazado por un medio fresco que contiene el virus recién cosechado y concentrado, los factores de crecimiento frescos y el polibreo.

Análisis de PCR para detectar el vector ASM / MFG

Se utilizó un cambio en nuestro procedimiento descrito anteriormente. Se han amplificado las secuencias de ASM endógenas y MFG endógenas y MFG endógenas usando un cebador de detección común, EXON 3 ‘TGCTGAGGATCGGACIGGAGA CAA -3′ (P1), construido a partir de ASM HUMANO Y MURINO EXON 3 y dos cebadores antisentrados específicos de dos especies, 5’-gggtaggtgacagaagattga-3 ‘(p2) y 5′-ggcacaaggcaggcag-3’ (p3), construidos desde el mouse y el ASM humano Human Intron ASM, respectivamente. Los pares de cebadores P1 y P2 han amplificado un producto genómico genómico murino específico de 211 PB, mientras que los pares de cebadores PL y P3 han amplificado un producto de 554 BP del vector MFG específico del hombre. Cada reacción de amplificación (aproximadamente 100 μl de volumen final) contenía 200 PMOL de PRIMER P1, 100 PMOL PRIMERS P2 y P3, ADN genómico de 300 ng, tampón de 1x PCR, 1, 5 mm de MgCl 2, 5u Taq Polymerase (Promega, Madison, WI, USA) y 200 m m cada uno de DNTP. Se generó una curva estándar utilizando mezclas de ADN como se describe anteriormente.20 Después de la amplificación (30 ciclos, cada uno de los cuales comprende 1 minuto a 93 ° C, 61 ° C y 72 ° C), los productos de PCR se separaron mediante electroforesis en una solución de agarosa. a 1, 5%. Geles y coloreados con bromuro de etidio. La intensidad de las cintas se determinó utilizando el paquete de software NIH Imager.

Transplante de trasplante de trasplante

Treinta y dos 2 días más antiguos del mouse Asmko se utilizaron como receptores. Antes de recibir el trasplante, los destinatarios se sometieron a una dosis única de la irradiación total del cuerpo de 200 CGY desde una doble fuente de 137 CS (tasa de dosis, 80 cgy / min). Cada animal recibió un total de 1 × 10 6 células / g de peso corporal inyectado por vía intravenosa. Los compañeros de basura de la misma edad (Normal y Asmko, N = 5 para cada uno) se utilizaron como indicadores de irradiación (es decir, irradiados, pero no trasplantados). Los animales se mantuvieron de acuerdo con un ciclo ligero / oscuro de 12 horas, agua a voluntad y purina para roedores Purina 5001. No se administró antibióticos u otro tratamiento de soporte a ninguno de los animales antes o después del trasplante.

Evaluación posterior al injerto

Los pesos de los animales y las cookies trasplantadas se han registrado mensualmente. La sangre periférica también se obtuvo mediante sangrado de órbita retiniana para un análisis mensual de las enzimas en los glóbulos blancos (WBC) (ver más abajo).

Hibridación in situ del cromosoma Y

Las muestras de sangre se tomaron 5 meses después del trasplante para estimar el trasplante en los receptores. Los WBC se han aislado utilizando un tampón hemolítico (NH 4 0, 1 M, NAHCO3 12 M, EDTA 10 M M, PHO 8, 0), fijado en una solución de carnoy (ácido metanol-acético 3: 1) y colocado en cuchillas de microscopio . Las células se trataron con HCl 0, 1 m que contenía 0, 05% triton X-100 durante 7, 5 minutos a 37 ° C, fijadas en paraformaldehído en tamponado al 1% (pH 7, 4) durante 15 minutos a 24 ° C, luego deshidratado en etanol. Las hibridaciones se llevaron a cabo incubando las cuchillas durante la noche en una habitación humidificada a 37 ° C con una solución (2x SSC, 50% de formamida, sulfato de dextrano al 10%, 0, 1% entre 20, 0, 5 mg / ml de ADN de esperma de salmón ) que contiene 4 ng / μl de una sonda de sensor específica de un ratón biotinilado [M34) (M34) .40 Después de la hibridación, las cuchillas se lavaron y se desarrollaron utilizando una avidina conjugada de fluoresceína (5 μg / ml) (Sigma, St Louis, MO, USA ), seguido de amplificación con anti-avidin biotinilado (2 μg / ml) (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE. UU.). Luego, se realizó una segunda incubación / amplificación con el conjugado de fluorescein-avidina para maximizar la sensibilidad de detección. Las células fueron luego en contra de color con yoduro de propidio (100 μg / ml) (SIGMA) y se montaron en un medio anti-arbolado (TRIS-HCl 10 mM PH 7, 5 que contenían 20 mg / ml de DABCO (trietilendiamina- 1, 4-DIAZABICYCLEO Octane; Sigma) en glicerol). Se marcaron 300 núcleos para determinar el porcentaje de células derivadas de los donantes en la sangre injertada.

Prueba de inmunoensorbente enzimática (ELISA) e inmunoprecipitación

Para detectar la presencia de anticuerpos dirigidos contra los HPS recombinantes expresados, las dosis ELISA se realizaron en plasma de ratones tratados y no tratados. El hasm purificado se incubó durante 18 horas en placas de microtitulación de 96 pocillos. Los pocillos se lavaron 3 veces con el tampón de lavado 1 (WB1, TRIS 10 MM, PH 7, 5, NaCl 150 mm, entre 20 0, 05%), luego se bloquean durante 1 hora con BSA a 3% en PBS a temperatura ambiente. . Las diluciones de plasma del ratón tratadas y no se tratan en WB1 (100 μl a una dilución de 10 -2, 10 -3, 10 -4) se agregaron a los pocillos y se incubaron a 37 ° C durante 3 h. Los pocillos se lavaron 3 veces con WB1, luego se agregaron 100 μl de cabra anti-mouse (Sigma) conjugado con peroxidasa (dilución 1: 500 en WB1) y se agregaron una incubación de 2 horas a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron nuevamente 3 veces con WB1 y 2 veces con el tampón de lavado 2 (10 mm pH 7, 5, NaCl 150 mm). Luego se agregó un sustrato de peroxidasa a los pocillos (100 pies) y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se usó un lector de placas ELISA automatizado para determinar la absorbancia a 405 nm.

Las pruebas de inmunoprecipitación se utilizaron para determinar si los anticuerpos presentes en los ratones tratados inactivaron la enzima expresada. Se incubó una solución de 500 U de Hasm, 1 ml de PBS, 10 μl de plasma de ratón (tratamiento o indicador) y 1 mg / mg de BSA se incubó durante 18 h a 4 ° C en una rueda giratoria. A continuación, se agregaron 100 μl de proteína G-Sepharosa diluida a 1: 1 en PBS a la solución y se incubaron durante 4 horas a 4 ° C después de la centrifugación a 14 000 rpm durante 2 minutos, la actividad de ASM en sobrenadantes y pellets fue Analizado.

Ass Adayos de actividad

La esfingomielina covalentada con la sonda fluorescente de bodipy (Bodipy DodeCanoyle Spingosyl fosfocholine, BOD12-SPM) se ha sintetizado como se describió anteriormente para la esfingomielina de la ródamina Lissamina (LR12- SPM) 41, con la excepción del ácido bodipy dodecanoico (sondas moleculares, Eugene, Oro, EE. UU.) Condensada con esfingosil fosfocolina. La escisión del DBO12-SPM por el ASM libera la ceramida fluorescente, que se puede cuantificar después de la separación por CCM u extracción orgánica. Los WBC o los tejidos se obtuvieron como se describieron anteriormente18 y homogeneizados en Triton X-100 a 0, 2% en hielo usando tres 10 segundos de un homogeneizador de tela Potter-Elvehjem (Thomas Scientific, Sweedesboro, NJ, EE. UU.). La proteína total se determinó mediante el método de Stein et al.42. La mezcla de ensayo estándar con 15 μl de ASM consistía en 10 μl de muestra (células o telas homogeneizadas) y 2 Nmol de DBO12-SPM suspendido en tampón de acetato de sodio 0, 1 m, pH 5, 2., que contiene 0, 6% triton x -100 y 5 mm EDTA (para detectar la actividad del ASM no dependiente de zinc) o ZNCL 2 0.1 mm (para detección de la actividad L ASM estimulada por el zinc) .43 después de la incubación de la mezcla de prueba a 37 ° C (arriba a 3 h), las muestras se cargaron en placas de cromatografía de capa fina (TK Silica Gel LK6 D 60, Whatman, Clifton, Nueva Jersey, Estados Unidos) y se resolvió utilizando una mezcla de cloroformo / metanol (95: 5 V / V). Después de la resolución, la cinta que contiene la ceramida marcada con fluorescencia se raspó de las placas CCM, se extrajo en una mezcla de cloroformo / metanol / agua (1: 2: 1 v / v) durante 15 minutos a 55 ° C y se cuantificó en un espectrofluorómetro. ( 204-A Espectrofotómetro de fluorescencia, Perkin Elmer). El instrumento se ha establecido en la excitación y las longitudes de onda de emisión de 505 y 530 nm, respectivamente.

El análisis de esfingomías

Las tasas de línea Spexyeline (SPM) se determinaron desde el contenido de fosfato de cada muestra.44 Los tejidos (cerebro, hígado, pulmón y bazo) se homogeneizaron en una mezcla de cloroformo / metanol (1: 2 v / v) para una vista. Extracción de lípidos. Se llevó a cabo una hidrólisis fosfolipídica alcalina en muestras de hígado, pulmón y bazo en KOH 0, 4 N / metanol al 90% durante 2 h a 55 ° C para prevenir la interferencia de plasmolifane y otros fosfolípidos en los extractos cerebrales, se realizó una hidrólisis ácida. En estas muestras utilizando HCl 0, 6 m en etanol durante 30 minutos a 37 ° C antes de la hidrólisis alcalina. Después de la hidrólisis, las muestras se incubaron con ácido perclórico (70%) durante 40 minutos a 180 ° C, luego se trataron con molibdato de amonio a 0, 5% y un reductor de FISKE y SUBBAW (4 mg / ml; SIGMA) durante 10 min en 100 ° C. La absorbancia a 830 nm se midió en un espectrofotómetro (modelo 1201, Milton Roy Spectronic, Rochester, NY, EE. UU.).

Preparación del tejido para la histología

Los ratones se han anestesiado con la ketamina (Sigma; 0, 5 g / kg de peso corporal) y sujeto a infusión cardíaca. Se realizó una incisión en la aurícula derecha para permitir que la sangre fluya, y se introdujo una cánula en la aorta a través del ventrículo izquierdo, entregando 50 ml de una solución caliente a 0, 9% de NaCl. Las muestras de tejido para microscopía óptica se fijaron en formalol tamponado al 10%, incluido en parafina, cortadas en corte y color en hematoxilina y eosina. Las muestras de SNC se tomaron después de la infusión de glutaraldehído, posicionadas en tetróxido de ósmosis, incrustado en un epon, cortadas en corte y coloreado con metileno azul II.

Immunodetección de células Purkinje.

Los tejidos fueron Fijado por infusión vascular con formaldehído almacenado al 4% (de paraformaldehído) y se obtuvieron recortes de 50 μm de lo cerebally por vibratoma. Las secciones se trataron con metanol / peróxido de hidrógeno para eliminar la actividad de la peroxidasa endógena, bloqueada con una solución al 10% de cabra normal y al 10% de suero de culo normal, con un 1% de bovino en suero en suero, a 0, 1% de gelatina y 0, 01% Azida de sodio en PBS, seguido de un tratamiento 18 h de incubación con antisuero de conejo anti-calbindina (SIGMA) (Dilución 1: 5000 preparada en el mismo tampón). Luego, los cortes se lavaron durante 4 a 8 horas en PBS y se incubaron durante 18 horas en un inmunorreactivo anti-conejo diluido compuesto por un fragmento FAB2 conjugado a la peroxidasa (alto en el burro), absorbidamente absorbido para no reaccionar a los inmunoglobins de ratón (Amersham) . Después de 4 a 8 horas de lavado, se desarrollaron cortes en una mezcla de hidrógeno, hidrógeno seco y lamelado estándar.

Análisis estadísticos

Análisis Kaplan – Meier Actuarial (Figura 2) Se llevó a cabo utilizando el sistema estadístico de asistencia a la incautación y recuperación de los datos del paciente (CASPER). Para los datos ilustrados en las Figuras 1 y 3, los valores promedio se representan con los errores estándar del promedio. Los valores P se calcularon utilizando una prueba T pareada.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por subvenciones de investigación del Instituto Nacional de Salud (HD 28607 y HD 32654), de La fundación de malformaciones congénitas March of Dimes (1 a 2224), una subvención (RR 0071) del Centro Nacional de Investigación en el Monte Sinaí. Centro de Investigación Clínica General y una subvención (93-00015) de la Fundación Científica Binacional Americana-Israel. Nos gustaría agradecer al Dr. Lalji Singh, el centro de la biología celular y molecular (India) para proporcionar la sonda específica del cromosoma Y.

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